Asosiy tushunchalar: dnk sekvenirlash

Asosiy tushunchalar:

• 
  DNK sekvenirlash – DNK boʻlagidagi nukleotidlar (A, T, S va G) ketma-ketligini aniqlash jarayoni.
  
• 
  Sanger boʻyicha sekvenirlashda nishon DNKdan koʻplab nusxalar olinib, turli uzunlikdagi fragmentlar hosil qilinadi. Fluoressent “terminator zanjir” nukleotidlari fragment oxiriga birikadi va ularni aniqlashga imkon beradi.
  
• 
  Yangi avlod sekvenirlash usuli yangi, keng yondashuvli, yuqori tezlikka ega va kamxarajat talab usuli hisoblanadi.
  

Sekvenirlash nima?
Genom ketma-ketligi toʻgʻrisida eshitgan boʻlsangiz kerak. Misol uchun, koʻp yillik harakatlar natijasida inson genomi 2003-yilda toʻliq oʻrganildi. Lekin genom yoki DNK kichik bir fragmentining ketma-ketligi nimani anglatadi?
DNK sekvenirlash – DNK boʻlagi tarkibidagi asoslar (A, T, S va G) ketma-ketligini aniqlash jarayoni. Bugungi kunda kerakli uskunalar va anjomlar yordamida DNKning kichik boʻlagini sekvenirlash nisbatan oson.
Butun genom (organizmdagi barcha DNK)ni sekvenirlash hamon murakkab vazifa boʻlib qolmoqda. Bu jarayon genom DNKsini koʻplab kichik boʻlaklarga boʻlish, boʻlaklarni sekvenirlash va bitta uzun zanjirga yigʻishni talab qiladi. Biroq soʻnggi yigirma yil ichida ishlab chiqilgan yangi usullar tufayli hozir genomni sekvenirlash “Inson genomi loyihasi”ga qaraganda ancha tezroq va arzonroq.
Sanger boʻyicha sekvenirlash: zanjir terminatsiyasi usuli
DNKning 900 asos juftiga ega boʻlgan qismi asosan Sanger boʻyicha sekvenirlash yoki zanjir terminatsiya deb nomlanuvchi usullar yordamida sekvenirlanadi. Sanger boʻyicha sekvenirlash 1977-yilda britaniyalik olim Fred Sanger tomonidan kashf qilingan.
Inson genomi loyihasida Sanger boʻyicha sekvenirlash inson DNKsining nisbatan kichik fragmentlari ketma-ketligini aniqlash uchun ishlatiladi. (Ushbu fragmentlar 900 aj dan kam boʻlmasligi kerak edi, lekin tadqiqotchilar koʻp marotaba Sanger usulini qoʻllash yordamida har bir fragmentni oʻrganish imkoniga ega boʻldi.) Fragmentlar DNKning kattaroq qismlari va butun xromosomaga birlashish uchun ketma-ket tizilib, bir-birining ustiga joylashadi.
Garchi hozir genom tezkor va arzon usullar yordamida sekvenirlanayotgan boʻlsa ham, Sanger boʻyicha sekvenirlash DNKni klonlash yoki polimeraza zanjir reaksiyasi (PZR) orqali hosil qilingan DNKning alohida fragmentlarini sekvenirlash uchun qoʻllanadi.
Sanger boʻyicha sekvenirlashda ishlatiladigan ingrediyentlar
Sanger boʻyicha sekvenirlashda DNK nishon qismining nusxasi koʻp marotaba olinadi. Buning uchun kerakli ingrediyentlar inson organizmidagi DNK replikatsiyasi yoki DNKni in vitro koʻpaytiruvchi polimeraza zanjir reaksiyasi (PZR) uchun kerak boʻladigan ingrediyentlar bilan oʻxshash. Bular quyidagilar:

• 
  DNK polimeraza fermenti
  
• 
  Praymer. DNKning bir zanjirli kichik qismi boʻlib, andoza DNKga bogʻlanadi va polimeraza uchun “boshlab beruvchi” vazifasini bajaradi.
  
• 
  Toʻrtta DNK nukleotidlari (dATF, dTTF, dSTF, dGTF)
  
• 
  Ketma-ketligi aniqlanishi kerak boʻlgan andoza DNK
  

Lekin Sanger boʻyicha sekvenirlash reaksiyasi uchun oʻziga xos (yagona) ingrediyent ham kerak boʻladi:

• 
  Dideoksi yoki zanjir terminatsiyalovchisi – har biri har xil rangli boʻyoq bilan boʻyalib nishonlangan toʻrtta nukleotid (ddATF, ddTTF, ddSTF, ddGTF)
  

Dideoksi nukleotidlar doimiy yoki deoksi nukleotidlarga oʻxshash, lekin bitta farqi – uglevod halqasidagi 3’ uglerodda gidroksil guruhning yoʻqligi. Doimiy nukleotidda 3’ gidroksil guruh mavjud zanjirga yangi nukleotidlarni biriktirish uchun “ilgich” vazifasini bajaradi.
Zanjirga dideoksi nukleotidi birikkach, boʻsh gidroksil guruhi qolmaydi va yangi nukleotidlar birikmaydi. Zanjir dideoksi nukleotid bilan tugaydi, asos turiga qarab (A, T, S yoki G) boʻyoqning maʼlum bir rangi bilan boʻyaladi.