Biotexnologiya

T-DNK vektor vazifasini bajarishi mumkin
T-DNK o'simlik genomiga begona genlarni kiritish uchun ideal vektor bo'la 
oladi. 
Sababi T-DNKda 2ta ajoyib hususiyat bor: 
agrobakteriya ikki pallali o'simliklarni deyarli barchasini transformatsiyalaydi 
(hattoki boshoqli ekinlarni ham); 
T-DNK o'simlik genomiga joylashib oladi. Oqibatda T-DNK genlari o'simlikning 
keyingi avlodlariga dominant belgi sifatida Mendel' qonunlari bo'yicha 
irsiylanaveradi. 
Transgen o'simlik yaratish uchun Ti-plazmidaning T-DNK qismiga kerakli 
genlar kiritilsa bas, qolgan barcha ishni bakteriyani o'zi bajaradi. Biroq recombinant 
DNK olish uchun Ti-plazmidaning o'lchami juda katta. Ushbu muammoni hal qilish 
maqsadida quyidagi rasmda ko'rsatilgan tehnologiya ishlab chiqilgan.

---

15-rasm. Ti-plazmidadan vektor sifatida foydalanish. Dastlab Ti-plazmidadan restriktazalar yordamida T-DNK kesib 
olinadi. Kesib olingan T-DNK 
E. coli bakteriyasining 
pBR322 plazmidasiga kiritiladi. pBR322 plazmidasidagi T-DNKga 
o'simlik geni joylashtiriladi. Gibrid plazmida hosil bo'ladi. Bu plazmida agrobakteriyaga qayta kiritiladi. Agrobakteriya 
esa o'simlikka yuboriladi.
Dastlab Ti-plazmidaning T-segmenti restriktazalar bilan kesiladi. T-segmentni 
ko'paytirish uchun 
Escherichia coli bakteriyasinng
pBR322 plazmidasiga kiritiladi. 
pBR322 replikatsiyalanganda undagi T-segmentni soni ham ko'payadi. Bu jarayon 
klonlash 
deyiladi. Tarkibida T-segment saqlagan pBR322 plazmidasi etarlicha 
klonlangandan keyin bakteriyadan ajratiladi. Ajratilgan gibrid plazmidaga o'simlik 
geni joylashtiriladi va yana klonlash uchun 
Escherichia coli
bakteriyasiga qayta 
kiritiladi. Klonlangan plazmidalar 
Escherichia coli
bakteriyasidan ajratiladi va 
agrobakteriya sitoplazmasiga kiritiladi. So'ngra agrobakteriya o'simlikka yuboriladi. 
Agrobakteriyadagi gibrid plazmidaning T-segmenti o'simlik genomiga qo'shilib 
ketadi. Transgen o'simlik ana shunday tehnologiya asosida yaratiladi.
Yuqorida keltirilgan tehnologiyani biroz soddalashtirish mumkin. Buning 
uchun binar vektor sistemalardan foydalaniladi. Bunda agrobakteriya hujayrasida 
ikki hil modifikatsiyalangan Ti-plazmida bo'lishi kerak. Plazmidalarning biridafaqat 
vir-zona bo'ladi. vir-zona T-DNK kesilishi uchun javobgar. Bunday plazmidalar 
yordamchi plazmidalar deyiladi.

---

Ikkinchi plazmidada esa faqat o'simlik geni kiritilgan T-DNK bo'ladi. 
Ikkala plazmida bitta hujayraga joylashtiriladi. Agrobakteriya ikki hil 
plazmidasi bilan birga o'simlikka yuboriladi. Yordamchi plazmidaning vir-zonasi 
ikkinchi plazmidaning T-segmentini kesadi. Yuqorida ta'kidlanganidek, T-segment 
o'simlik genomiga birikadi.
Qisqa qilib aytganda, Ti-plazmida asosidagi ideal vektor sistema quyidagi 
elementlar va hossalarga ega bo'lishi zarur:
1)
o'simlik genomiga barqaror qo'shilishi uchun barcha kerakli signallar, 
genlarning ekpressiya sistemasi (o'simlik polimerazalari «taniydigan» promotor), 
transformatsiyalangan hujayralarni selektsiyasi (saralash) uchun marker;
2)
vektor sistemada onkogenlar bo'lmasligi kerak. Ular o'simlik hujayralarini 
differentsiyallanishini to'htadi.
Onkogenlarni yo'qotish uchun 
transpozonli mutagenez
(transpozon - ko'chib 
yuruvchi genetik element) usuli qo'llaniladi. T-DNKga transpozonlar kiritilsa, 
o'simlikda
shish hosil qiladigan genlar (
iaaM, iaaH, ipt
) «o'chiriladi». Transpozonlar 
T-DNKni o'simlikka o'tishiga halaqit qilmaydi. Transpozonli mutagenezda Tn5, Tn7 
bakterial transpozonlardan foydalaniladi. 
Ti-plazmidani modifikatsiyalashda restriktsiya saytlariga (restriktazalar kesadigan 
uchastkalar) ham e'tibor berish kerak. Modifikatsiyada EcoR1, Hind III, BamH1 va 
boshqa restriktazalar ishlatiladi. Ba'zida ma'lum bir saytning 18-20uchastkasidan 
taniydigan turli hil restriktazalar bo'ladi. Shuning uchun bunday uchastkalar 
polilinkerlar
deb ataladi.
Bundan tashqari, vektor molekulalarini konstruktsiyalashda promotorlarga ham 
e'tibor berish kerak. Promotor quyidagi hossalarga ega bo'lishi kerak: 
faol ekspressiya; 
to'qima va organspetsifik ekspressiya; 
boshqarilish imkoniyati. 
Ayrim genlar yuqori temperatura ta'sirida faollanadi. Bunday genlar 
boshqariladigan promotorlarga misol bo'ladi. Ayrim genlar zahira oqsillari (masalan, 
boshoqli o'simliklarda uchraydigan zein oqsili) sintezini nazorat qiladi. Ular to'qima 
spetsifik ekspressiyaga misol bo'ladi. 
O'simliklar gen muhandisligida ko'p ishlatiladigan promotor - CAMV 
(
cauliflower mosaic virus
– gulkaram mozaikasi virusi) promotori. CAMV 
promotoriga ulangan genlar o'simlikning barcha to'qimalarida faol ekpressiyalanadi.
Va nihoyat vektorlarda markerlar ham bo'lishi zarur. Chunki transgen o'simliklar 
marker genlar yordamida saralanadi. Marker genlar reporter genlar ham deyiladi. 
Marker genlar soni anchagina. Misol uchun, 
luxA va luxB genlari. Ular tunda yonib 
turadigan hasharotlar DNKsidan ajratilgan. luxA va luxB genlari lyutsiferaza 
fermenti sintezini boshqaradi. Lyutsiferaza oksidlangan lyutsefirin pigmentini 

---

lyutsefiringa o'tish reaktsiyasini katalizlaydi. Tungi hasharotlarning yonib turishiga 
luytsefirin pigmenti sababchidir. luxA va luxB marker genlarini saqlagan transgen 
o'simlikni boshqalaridan ajratib olish oson. Chunki ular, yuqorda aytganimizdek, 
chiroq shu'lasi kabi yonib turadi.
Ohirgi paytlarda pgfp markeri ham keng ishlatilmoqda. Bu gen
GFP-oqsili (green 
fluorescent protein) sintezini nazorat qiladi.
U Acquorea victoriameduzasining 
DNKsidan olingan. Tanasida pgfp markeri saqlagan transgen o'simlikka 
ul'trabinafsha nur tushurilsa, u yashil rang berib tovlanadi.
T-DNK orqali o'simlik hujayralarini transformatsiyalashning an'anaviy usuli - 
mahsus jarohatlangan yosh o'simlik novdasiga tarkibida
Ti-plazmida mavjud 
agrobakteriyani 
kiritish. Hozirda transgen o'simlik olishning bir necha hil usullari 
ishlab chiqilgan. Hattoki mahsus
«Shotgun» qurilmasi yaratilgan. DNK molekulalari 
vol'fram sharchalar bilan o'raladi va «Shotgun» qurilmasida o'simlik tanasiga 
miltiqdan o'q otish kabi otiladi.