Biotexnologiyanin nəZƏRİ Əsaslari

MÜHAZİRƏ 3

BİOTEXNOLOGİYANIN NƏZƏRİ ƏSASLARI

Mövzunun planı:

1. Biotexnologiyada əsas terminlər və təyinlər

2. Mikroorqanizmlərin inkişaf mərhələləri və kinetikası

3. Mikroorqanizmlərin artım kinetikası

4. Mikrob qıcqırması və metabolizmin məhsulları

5. Səthi fermentasiya

6. Nazik təbəqədə gedən fermentasiya və ya səthi fermentasiya

7. Qalın təbəqədə gedən fermentasiya

8. Substratın qarışdırılması ilə gedən fermentasiya

Biotexnologiyada mikroorqanizmlərin – produsentlərin təmiz kulturlarından istifadə edilir, belə ki, bu qabaqcadan məlum xüsusiyyətlərə malik məhsulların alınmasına şərait yaradır. Bütün mikroorqanizmlər sənaye miqyasında istifadə oluna bilmir. Yalnız xarici faktorların təsiri altında istehsalata lazım olan məhsulu külli miqdarda sintez edən mikroorqanizm-produsentlər tətbiq edilə bilər. Mikroorqanizm-produsentlərə bir çox tələblər qoyulur:

• çox kiçik ölçüdə olub, hava axını və başqa vasitələrlə asanlıqla yayılır. Yer kürəsinin elə bir sahəsi yoxdur ki, orada mikroorqanizmlərə rast gəlinməsin;

• yüksək sürətlə çoxalma qabiliyyətinə mailk olan, mikroorqanizmlər hər 30-60, bəzi bakteriyalar isə 8-10 dəqiqədən bir bölünür. Mikroorqanizmlərin çoxalma sürəti bitki və heyvanların çoxalma sürətindən dəfələrlə böyükdür. Məsələn, mikrobioloji yem kütləsi istehsal edən ən kiçik zavod sutkada 30 t maya göbələyi istehsal edir ki, onun da tərkibində 15 t yüksəkkeyfiyyətli zülal vardır. İribuynuzlu qaramaldan sutka ərzində 15 t zülal almaq üçün 50000 baş heyvan lazımdır;

• canlı orqanizmlərin yaşaya bilmədiyi yüksək temperaturda yaşayıb çoxalır. Bütün canlılar, bir qayda olaraq 40-50°C-dən aşağı temperaturda yaşayır. Termofil mikroorqanizmlər isə 60-110°C-də inkişaf edir. Okeanın dibində sulfidli termal sularda 250°C-də bakteriyalara təsadüf edilir;

• yuxarı qatılıqlı turşu və qələvi mühit yüksək təzyiq və başqa ekstremal şəraitdə inkişaf edərək çoxalır. Asedofil mikroorqanizmlər pH=1 olan mühitdə asanlıqla fəaliyyət göstərir. Qırmızı qalobakteriyalar xörək duzunun doymuş məhlulunda çoxalır;

• müxtəlif üsullarla qidalanır. Heterotrof mikroorqanizmlər heyvanlar kimi hazır üzvi maddələri mənimsəyir. Bəzi növlər parazit həyat tərzi keçirir. Əksər mikroorqanizmlər tərkibində azot və karbon qidası, mineral elementlər olan sadə sintetik mühitdə bitir;

• müxtəlif qidalı mühitdə bitərkən çoxlu miqdarda metaballitləri sintez edib toplayır. Bunun nəticəsində praktiki olaraq mikroorqanizmlərdən fermentlər, polisaxaridlər, antibiotiklər, aminturşular, toksinlər və üzvi turşular alınır;

• müxtəlif üzvi birləşmələri tam parçalamadan bir şəkildən başqa şəklə çevirir və ya transformasiya edir. Mikroorqanizmlərin bu xassəsi onlardan katalizator kimi geniş istifadə etməyə imkan verir;

• müxtəlif amillərin təsirindən metabalizm proseslərini dəyişə bilir. Bu xassəyə əsasən hüceyrədə gedən biokimyəvi prosesləri istənilən istiqamətə yönəltmək olar;

• mutagenlərin təsirindən irsi əlamətlərini dəyişib faydalı xassə qazana bilir. Hazırda mikrobiologiya sənayesində mutant ştammlar – superprodusentlərdən müvəffəqiyyətlə istifadə edilir;

• genomlarında xromosomdan kənar irsiyyət elementləri – plazmidalar vardır. Onlar mikroorqanizmlərdə irsi xassələrin bir hüceyrəsini təmin edir və eyni zamanda əlavə genetik məlumat daşıyır.

Aşırı sintez mikroorqanizmin müəyyən bir məhsulu fizioloji tələbatdan artıq miqdarda sintez etmək qabiliyyəti olub, təbiətdə çox rast gəlinir. Bu xüsusiyyətə malik mikroorqanizmlər ilk dəfə insanın təsərrüfat fəaliyyətində istifadə olunmuş və bununla da daha məhsuldar formaların təbii seçimi aparılmışdır.

Sənayedə ştammların üç növü tətbiq edilir: təbii və süni seçimlə tez-tez təkmilləşdirilmiş təbii ştammlar; induksiya mutasiyası nəticəsində dəyişdirilmiş ştammlar; genetik və ya hüceyrə mühəndisliyi üsulları ilə alınan kultur ştammlar.

Adətən seçməklə yüksək aktiv produsentlər almaq olur, ona görə orqanizmin təbiətini lazımi istiqamətdə dəyişdirmək məsələsi ortaya çıxır. Bunun üçün seleksiya üsullarından istifadə edilir.

Seleksiya – mutantların, yəni irsi xüsusiyyətləri insan tərəfindən əsaslı surətdə dəyişdirilmiş mikroorqanizmlərin istiqamətli şəkildə seçimidir.

Mikroorqanizmlərin təbii ştammları qida mühitində kifayət qədər lazımi miqdarda məhsul nə ifraz etmək, nə də toplamaq qabiliyyətinə malik deyildir. Bu səbəbdən seleksiyanın vəzifəsi mikroorqanizmlərin müəyyən bir maddəni təbii olaraq istehsal etmək qabiliyyətini yüksəltməklə yanaşı, hətta yabanı formalı ştammlardan müəyyən bir maddə sintez etmək qabiliyyətinə malik yeni produsentin yaradılmasıdır. Bu məsələlər hüceyrənin fenotipinə təsir göstərən təbii ştammlarda irsi dəyişikliklərin – mutasiyaların alınması ilə həyata keçirilir. Spontan mutasiyalar mikrob populyasiyaların yeni şəraitə uyğunlaşmasına kömək edir. Mutasiyalar mikroorqanizmlərin təbii müəyyən bir maddəni sintez və istehsal etmək xüsusiyyətlərinin gücləndirilməsinə, hətta yeni xüsusiyyətlərin – külli miqdarda maddə sintez etmək və istehsal etmək kimi xüsusiyyətlərin yaranmasına gətirib çıxarır. Seleksiyanı sürətləndirmək üçün fiziki, kimyəvi və bioloji mənşəli mutagen amillər tətbiq edilərək induksiya mutagenezindən istifadə edilir. Universal fiziki mutagenlərə ultrabənövşəyi şüalanma, rentgen şüaları və s. daxildir; mutagen təsirli kimyəvi amillərə – azotlu iprit, nitrozaminlər, karbon tetrachlorid və digər kimyəvi maddələr; faqlar bioloji mutagenlərdir.

Beləliklə, mikroorqanizmlərin seleksiyalaşdırılmış ştammları nəsildə bərkidilmiş müəyyən qiymətli xüsusiyyətlərə malikdir. Lakin mutasiyalar təsadüfi olaraq yaranır, ona görə də gen və ya genetik mühəndislik – in vitro şəraitində genetik rekombinasıya daha geniş tətbiq olunur.

Pekombinasiya – 2 xromosom arasında gen mübadiləsidir. in vitro şəraitində təbii və ya sintetik DNT fraqmentlərinin hüceyrədə replikasiya olunma qabiliyyətinə malik molekullar ilə birləşməsindən alınan DNT molekulları rekombinat DNT adlanır. Bu yanaşma hüceyrəsinə heyvan və insan genləri daxil edilmiş bakteriyalar, əsasən də bağırsaq çöpü bakteriyaları üzərində işlənib hazırlanmış və onun replikasiyasına nail olmağa çalışmışlar. İn vitro şəraitində rekombinasiya metodu müxtəlif növlərdən DNT-nin ayrılması, hibrid DNT molekulunun alınması və yeni əlamətlərin yaranması məqsədilə rekombinat molekulların canlı hüceyrələrə daxil edilməsindən ibarətdir.

Məhsulu yüksək sintez etmək qabiliyyətinə malik mikroorqanizmlərin yeni ştammlarının alınma imkanlarını penisillin antibiotiki produsentinin nümunəsi üzərində baxaq. İlk əvvəl Penicillium chrysogenum ştammı 60 mq/l penisillin istehsal edirdi. Spontan mutasiyadan sonra çıxımı 150 mq/l olan yeni ştamm yarandı. Rentgen şüalanmadan sonra 300 mq/l penisillin verən mutant seçilmişdir. Ultrabənövşəyi şüalanmadan başqa iprit tətbiq edilən bir neçə mutagenez və seleksiya tsiklindən sonra, 7 q/l penisillin istehsal edən yüksək məhsuldar ştamm almaq mümkün oldu. Beləliklə, iki onillikdən çox bir müddət ərzində mutagenez və seleksiyanın 21 tsikli, penisillin çıxarının 55 dəfə artmasına imkan yaratdı. Mikroorqanizm-produsentlərin yeni ştammları hazırda 20 q/l-dən çox penisillin istehsal edir.

Məlumdur ki, mikroorqanizmlər yeni tam dəyərli qida mühitinə düşdükdə, o dəqiqə çoxalmağa başlamır. Bu mərhələ laq-faza adlanır. Bu mərhələdə kulturlar yeni yaşayış mühitinə öyrəşməyə başlayır. Ferment sistemləri aktivləşir, lazım gələrsə yeni ferment sistemləri sintez olunur, hüceyrə nuklein turşularının və digər birləşmələrin sintezinə hazırlaşır. Bu fazanın davametmə müddəti mikroorqanizmlərin fizioloji xüsusiyyətlərindən, qida mühitinin tərkibindən və becərilməsi şərtlərindən asılıdır. Bu fərqlər az və əkilən material çox olduqca, bu mərhələ qısa olur.

II mərhələ sürətli artım mərhələsi olub, hüceyrələrin bölünməsinin başlanğıcı ilə, popilyasiyanın ümumi kütləsinin və kulturun sürətinin daima artması ilə xarakterizə olunur; adətən o qısa olur.

Sonra loqarifmik və ya eksponensial artım mərhələsi – III mərhələ gəlir. Bu mərhələdə kulturun maksimal artım sürəti, əvvəlki və sonrakı nəslin yaranması arasındakı intervalın daimiliyi müşahidə edilir. Hüceyrələrin loqarifm sayı zamandan düz mütənasib asılıdır. Kulturun intensiv artımı və bölünməsi nəticəsində mühitdə olan qida maddələrinin miqdarı azalır. Bu kulturun artım sürətinin aşağı düşməsinə səbəb olur. Bundan başqa, mühitdə maddələr mübadiləsinin biokimyəvi proseslərinin normal gedişinə mane olan müəyyən konsentrasiyada metabolizm məhsulları toplanır. Bəzən qida mühitində çoxlu miqdarda o qədər hüceyrələr əmələ gəlir ki, yeni nəsil hüceyrələrə yer çatmır. Artım sürəti aşağı düşür, hüceyrələrin bölünmə sayı azalır, IV mərhələ – artım sürətinin azalması və ya zəifləməsi başlayır.

V mərhələ stasionar adlanır. Bütün canlı hüceyrələrin sayı və həcmi maksimuma çatır. Bu mərhələdə yeni yaranmış hüceyrələrin miqdarı ölmüş və avtolizə olunmuş hüceyrələrin miqdarına bərabərdir.

Müəyyən bir vaxt bu tarazlıq pozulur və ölmüş hüceyrələrin miqdarı çoxluq təşkil edir. VI mərhələ – tələf olma mərhələsinin artımı başlayır.

Populyasiyanın artım tsikli və inkişafı başa çatır. Bu mərhələ mikroorqanizmlərin tələfolması və avtolizi ilə xarakterizə olunaraq tələfolma mərhələsi adlanır. Bu mərhələdə hüceyrənin ehtiyat maddələri tükəndiyindən hüceyrələrin biokütləsi əsaslı dərəcədə azalır.

Mikroorqanizmlərin artım kinetikası. Hər bir kulturun yetişdirilməsi üçün aşağıdakılar lazımdır:

• həyat qabiliyyətli əkim materialı;

• enerji və karbon mənbəyi;

• biokütlənin sintezi üçün qidalı maddələr;

• artım ingibitorlarının olmaması;

• uyğun fiziki-kimyəvi şərait.

Əgər bütün bu tələblər yerinə yetirilərsə, dövri kulturun yaxşı qarışdırılmış şəraitində çoxalan, binar bölünmə yolu ilə birhüceyrəlilərin artım sürəti, mikrob kütləsinin qatılığına mütənasib olacaqdır, yəni:

dx/dt=μx,

burada, dx/dt – artım sürəti; μ – adətən artımın xüsusi sürəti adlanan mütənasiblik əmsalı; x – biokütlənin qatılığı.

Əgər μ dəyişməz olarsa, onda mikroorqanizmlərin kulturunun bu artımı eksponensial və ya loqarifmik adlanır. Mikrob biokütləsinin təkibi və ətraf mühit şəraiti dəyişilməz olduqda bu baş verir. Bu, həmçinin kultural mühitdə bərabər səviyyədə paylanmış birhüceyrəli orqanizmlər olan qarışıq kulturlara da aiddir.

Mikrob qıcqırması və metabolizm məhsullarına ilkin metabolitlər, ikinci metabolitlər, fermentlər və hüceyrə biokütləsinin özü aiddir.

İlkin metabolitlər – mikrobların artımı üçün vacib olan aşağı molekullu birləşmələrdir; onlardan biri makromolekulların tikinti blokları, digərləri isə kofermentlərin sintezində iştirak edirlər. Metabolitlərin sənayesi üçün vacib olanlar arasında amin turşularını, üzvi turşuları, purin və pirimidin nukleotidlərini, vitaminləri və s. göstərmək olar. Sənaye prosesləri üçün ilkin ştammlar rolunu təbii orqanizmlər və bu metabolitlərin sintezi tənziminin pozulması ilə kulturlar oynayır, belə ki, adi mikrob hüceyrələri ilkin metabolitləri külli miqdarda istehsal etmir.

İkinci metabolitlər – kulturların inkişafının son mərhələrində yaranan, mikroorqanizmlərin artımında tələb olunmayan aşağımolekullu birləşmələrdir. Kimyəvi quruluşuna görə ikinci metabolitlər müxtəlif qrup birləşmələrə aiddir. Onlara antibiotiklər, alkaloidlər, bitkilərin boy hormonları, toksinlər və piqmentlər aiddir.

Mikroorqanizmlərin səthi fermentasiyası 2 formada – duru və bərk qida mühiti səthində aparılır.

Aqarlı qida mühiti səthində becərilmə metodunu ilk dəfə XIX əsrdə Robert Kox təklif etmiş və o, müasir dövrdə də öz əhəmiyyətini itirməmişdir. Bu üsuldan kulturların fizioloji, biokimyəvi xassələrinin öyrənilməsi və muzeylərdə saxlanılmasında geniş istifadə edilir.

Mikroorqanizmlərin duru qida mühiti səthində becərilməsi sənayedə limon və itakon üzvi turşularının alınmasında geniş tətbiq olunur. Prosesdə göbələk kulturu stasionar duru qida mühiti səthində becərilir. Substrat məqsədilə şəkər çuğunduru və şəkər qamışından alınan melassa, ağac hidrolizatı, nişasta və s. istifadə edilir. Limon turşusunun sintezində ən səmərəli substrat kimi melassa işlədilir.

Texniki ferment preparatı istehsalında mikroskopik göbələklər və bir çox ağacçürüdən bazidili göbələklərin mitseliləri xırdalanmış və nəmləndirilmiş bitki tullantıları səthində becərilir. Məsələn, sellüloza fermentini almaq üçün Trichoderma lignorum, Aspergillus terreus kif göbələkləri, Bjerkandera adusta bazidili göbələyi nəmləşdirilmiş buğda və ya düyü kəpəyində becərilir. Göbələklər substratın aşağı qatlarında oksigenin miqdarı az olduğundan ancaq üst qatında bitərək inkişaf edir.

Nəmləndirilmiş bərk substrat üzərində kulturun becərilməsi prosesinə bərk fazalı fermentasiya deyilir. Bərk fazalı fermentasiyanın üç tipi məlumdur:

Nazik təbəqədə gedən fermentasiya və ya səthi fermentasiya. Substrat layının qalınlığı 3-7 sm-dən çox olmur və substrat qarışdırılmır, fermentasiya dəmir və ya ağacdan hazırlanmış tava və ya saclarda aparılır. Fermentasiyanın ümumi mənfi cəhəti geniş substrat səthinin tələb olunmasıdır.

Qalın təbəqədə gedən fermentasiya. Bu halda göbələk kulturunun substratın bütün qatlarında bitməsi üçün hava xüsusi qurğu vasitəsilə bütün laylara verilir və substrat qarışdırılmır. Substrat layının qalınlığı 0,6-1,5 n olur. Qalın təbəqədə gedən və ya bərk fazalı dərin fermentasiya xüsusi fermentyorlarda həyata keçirilir.

Fermentasiya gedən qarışığın laylarını oksigenlə təmin etmək üçün hər iki tərəfdən təzyiq ilə hava üfürülür.

Substratın qarışdırılması ilə gedən fermentasiya. Burada fırlanan pərlər və ya şneklərdən ibarət fermentyorlardan istifadə edilir.

Bərk fazalı fermentasiya prosesi maye fazasında deyil, bərk substrat: su hava sərhədində gedir və asan mənimsənilən nişastalı substratlardan tutmuş parçalanan ağac yonqarına qədər bütün bitki qalıqları fermentasiyaya uğrayır.

Bərk substrat səthində becərilmənin əsas şərtlərindən biri substratın rütübətliyidir. Rütubətlik aşağı olduqda hüceyrələr tərəfindən qida madddələrinin mənimsənilməsi prosesi və çoxalma zəifləyir, yuxarı olduqda isə mühitdə hissəciklər sıxlaşır, aerasiya və hüceyrələrin biokimyəvi fəallığı azalır. Hüceyrələrin bu üsulla becərilməsi üçün 58-60% optimal tələb olunur.

Yem kimi yaramayan müxtəlif bitki qalıqlarının mikrob zülalı ilə zəngin olan yemə çevirdikdə bərk fəzalı fermentasiyadan istifadə edilir.