FəSİl IV. Fermentativ fəallığın təyini üsulları. Fermentlərin vahidləri

FƏSİL V. FERMENTLƏRİN TƏSİR MEXANİZMİ

Fermentlərin kimyəvi təbiəti haqqında biliklərin hələ kifayət qədər olmadığı dövrdə fermentlərin təsir mexanizmini izah edən fərziyyələr homogen katalizin kinetikasının tədqiqinə və model təcrübələrə əsaslanırdı. Kimyəvi reaksiyaların sürətinin artması ferment tərəfindən substratın fəallaşdırılması ilə və ya radikalların iştirakı ilə gedən reaksiyaların zəncirvari mexanizmi ilə izah edilirdi. Sonralar məlum oldu ki, zəncirvari reaksiyalar fermentlərin iştirakı olmadan da gedə bilərlər. Fermentlərin təsir mexanizmi haqqında elmi cəhətdən əsaslandırılmış fərziyyə 1903-cü ildə Henri, 1913-cü ildə isə V.Anri, L.Mixaelis və M.Menten tərəfindən irəli sürülmüşdür. Bu fərziyyənin düzgünlüyü fermentlərin kimyəvi təbiəti tam aydınlaşdırıldıqdan sonra isbat edilmişdir. Mixaelis-Menten fərziyyəsinə görə fermentativ kataliz zamanı ferment öz substratı ilə birləşərək davamsız ferment-substrat kompleksi əmələ gətirir ki, bu da reaksiya başa çatdıqda parçalanır, nəticədə sərbəst ferment və reaksiya məhsulu əmələ gəlir.

Ümumiyyətlə, fermentativ kataliz dörd mərhələdə baş verir (şək. 5.1):

1. 
   ferment və substrat arasında ion, kovalent və digər rabitələrin iştirakı ilə dönər kompleksin əmələ gəlməsi,
   
2. 
   substratın müəyyən dəyişikliyə uğraması və müvafiq reaksiya üçün fəallaşması,
   
3. 
   kimyəvi reaksiyanın baş verməsi,
   
4. 
   reaksiya məhsullarının ferment-məhsul kompleksindən dissosiasiya etməsi.
   

Fermenti E, substratı S, aktivləşmiş substratı S`, reaksiya məhsulunu isə P ilə işarə etsək, onda fermentativ reaksiyanın mərhələlərinin ardıcıllığı sxematik olaraq aşağıdakı kimi göstərilə bilər:

Beləliklə, fermentativ katalizin mexanizmi ferment-substrat komplekslərinin əmələ gəlməsinə əsaslanır. Lakin uzun müddət ərzində ferment-substrat kompleksinin əmələ gəlməsini təcrübi yolla sübut etmək mümkün olmamışdır, çünki ferment substratla çox qısa zaman müddətində qarşılıqlı əlaqədə olur və bu kompleks həddindən artıq labildir, yəni-davamsızdır.

Bu cür kompleksin əmələ gəlməsi ilk dəfə olaraq ingilis biokimyaçısı D.Keylin və onun əməkdaşı T.Mann tərəfindən spektroskopiya üsulu vasitəsilə sübuta yetirilmişdir. Sonralar B.Çansın laboratoriyasında aparılan işlər sayəsində ferment-substrat kompleksinin tədqiqini təmin edən daha təkmilləşdirilmiş və həssas spektrofotometrik üsullar təklif olunmuş və bu üsulun tətbiqi sayəsində bir sıra fermentlərin ferment-substrat kompleksləri öyrənilmişdir. Hal-hazırda müasir eksperimental və riyazi üsulların tətbiqi sayəsində bir sıra fermentativ reaksiyaların kinetik və termodinamik göstəriciləri, xüsusilə də aralıq ES-komplekslərinin dissosiasiya sabitləri, bu, komplekslərin əmələ gəlməsi və tarazlıq sabitləri müəyyən olunmuşdur.

Fermentlərin təsir mexanizmini izah edən ilk fərziyyələrdən biri 1890-cı ildə Emil Fişer tərəfindən irəli sürülmüşdür. “Açar-qıfıl” adlanan bu fərziyyəyə (şək, 5.2) əsasən ferment və substrat öz quruluşlarına görə bir-birinə yüksək dəqiqliklə uyğun gəlməlidirlər. Bu model fermentlərin yüksək spesifikliyini izah etsə də, keçid vəziyyətin praktikada müşahidə olunan stabilləşməsi faktını izah etmir.

Əgər ferment mürəkkəbdirsə, yəni fermentin fəal mərkəzini koferment təşkil edirsə, bu halda üçlük kompleks əmələ gələ bilər (şək. 5.3).

Fermentin katalitik fəallığı üçün a-spiralların möhkəm təmin edən elastik sahələrlə növbələnməsi böyük əhəmiyyət kəsb edir. Fermentativ katalizin bir sıra nəzəriyyələrində bu cür dinamik dəyişikliklərə böyük əhəmiyyət verilir. Belə ki, 1958-ci ildə D. Koşland “açar-qıfil” nəzəriyyəsinin “induksiya olunmuş uyğunlaşma” adlı modifikasiyasını təklif edir. Bu nəzəriyyəyə əsasən, fermentlər sərt deyil, elastik molekullardırlar və fermentin fəal mərkəzi substratla birləşdikdən sonra öz konformasiyasını dəyişə bilir. Bu nəzəriyyə ferment molekulunun konformasion dəyişikliklərinin substratla induksiya olunmasını sübut edən təcrübələrə əsaslanır. Digər sözlə, ferment yalnız substrat birləşdiyi anda qeyri-fəal R-formadan fəal (gərgin) T-formaya keçir (şək.5.4).

Şəkildən göründüyü kimi, substratın fermentə birləşməsi fəal mərkəzin konformasiyasının müvafiq dəyişikliklərinə səbəb olur və ya fəal kompleks, ya da aralıq ES-kompleksində fəal mərkəzin funksional qruplarının fəzada yerləşməsinin pozulması nəticəsində yaranan qeyri-fəal kompleks əmələ gəlir. Bəzi hallarda substrat molekulu da, fermentin fəal mərkəzində birləşdikdən sonra öz konformasiyasını dəyişir. “Açar-qıfıl” nəzəriyyəsindən fərqli olaraq, induksiya olunmuş uyğunlaşma modeli həm fermentlərin spesifikliyini, həm də keçid vəziyyətin stabilləşməsini izah edir.

Ferment və substrat arasında olan dəqiq uyğunluq, eləcə də bu uyğunluğun termodinamik və katalitik üstünlükləri katalitik proses üçün böyük əhəmiyyət kəsb edir. “İnduksiya olunmuş uyğunluq” nəzəriyyəsi ferment və substrat arasında təkcə fəza və ya həndəsi komplementarlılığın olmasını deyil, eləcə də fermenfin fəal mərkəzinin və substratın əks yüklənmiş qruplarının cütləşməsi sayəsində yaranan elektrostatik uyğunluğun olmasını nəzərə alır. Yüksək dərəcəli uyğunluq substrat və ferment arasında effektiv kompleksin əmələ gəlməsini təmin edir.

Ferment-substrat komplekslərinin əmələ gəlməsində hidrogen rabitələri, elektrostatik və hidrofob qarşılıqlı təsirlər, bəzi hallarda isə, kovalent və koordinasion rabitələr iştirak edə bilər (şək.5.5). Fermentin fəal mərkəzinin lövbər sahəsi və substrat molekulu arasında yaranan rabitələrin təbiəti haqqında məlumatı EPR (elektron-paramaqnit rezonansı), NMR (nüvə maqnit rezonansı), un. və İQ-spektroskopiya üsulları vasitəsilə əldə etmək olar.

Fermentlər də, digər katalizatorlar kimi, kimyəvi reaksiyaların gedişini termodinamik nöqteyi nəzərindən aktivləşmə enerjisinin aşağı salmaqla təmin edirlər. Aktivləşmə enerjisi müəyyən temperatur şəraitində bir mol maddənin bütün molekullarının fəallaşması üçün tələb olunan enerjidir. Digər sözlə, aktivləşmə eneriisi reaksiyanın işə salınması üçün lazım olan eneriidir. Ferment aktivləşmiş maddələrin sayını artırır və onlar daha aşağı energetik səviyyədə reksiyaya girmək qabiliyyətini qazanırlar. Bununla belə ferment reaksiyanın aktivləşmə eneriisini aşağı salır (şək.5.6). Şəkildən görünür ki, fermentativ reaksiya daha aşağı aktivləşmə enerfisi ilə xarakterizə olunur. Qeyd etmək lazımdır ki, fermentlər reaksiyanın sürətinə təsir etməklə, düz və əks istiqamətlərdə gedən reaksiyalar arasındakı tarazlığı dəyişmirlər və reaksiyanın sərbəst enerfisinin qiymətinə təsir etmirlər. Onlar sadəcə kimyəvi reaksiyanın tarazlıq vəziyyətinə çatmasını sürətləndirirlər.

Misal qismində AB — A + B reaksiyasına diqqət yetirək.

Əgər mühitdə E fermenti varsa, bu halda aşağıdakı reaksiyalar baş verəcək:

AB + E → ABE; ABE → BE + A və BE → E + B

Beləliklə, biz eyni nəticəni əldə etmiş olduq, yəni fermentlə kataliz olunan reaksiya nəticəsində də A və B maddələri əmələ gəldi, lakin bu zaman reaksiyada iştirak edən ferment də dəyişilməz olaraq reaksiya nəticəsində sərbəstləşir. Bu aralıq reaksiyalar, ilkin cəm reaksiya ilə müqayisədə, daha aşağı aktivləşmə ener/isi ilə gedir. Deməli, ferment kimyəvi reaksiyanı aktivləşmə enerjisinin aşağı səviyyəsi ilə xarakterizə olunan dolayı yolla aparır.

Fermentlərin təsiri altında reaksiyanın aktivləşmə enerjisinin azalmasını əks etdirən misallara diqqət yetirək. Məsələn, saxarozanın qlükoza və fruktozaya hidrolizi reaksiyası: katalizatorsuz bu reaksiyanın aktivləşmə enerfisi 134 kC/mol-a bərabərdir, katalizator qismində hidrogen ionları çıxış etdikdə reaksiyanın aktivləşmə eneriisi 104,7 kC/mol, β-fruktofuranozidaza (saxaraza) fermentinin iştirakı ilə isə 39,4 kC/mol təşkil edir. Deməli, β-fruktofuranozidaza fermentinin təsiri altında reaksiyanın aktivləşmə eneriisi, fermentsiz reaksiya ilə müqayisədə, demək olar ki, dörd dəfə azalır.

Hidrogen peroksidin su və oksigenə parçalanması reaksiyasına: 2H₂0₂ = 2H₂0 + O₂ diqqət yetirək. Katalizatorsuz bu reaksiyanın aktivləşmə ener/isi 75,3 kC/mol təşkil edir, katalizator qismində platin iştirak etdikdə - 49,0 kC/mol, katalaza fermentinin təsiri altında isə 5,4 — 7,1 kC/mol-a bərabər olur. Göründüyü kimi, katalizator reaksiyanın aktivləşmə enerfisini azaldır, həm də qeyri-üzvi katalizatorla müqayisədə ferment bu göstəricini əhəmiyyətli dərəcədə azaldır, bu isə fermentin yüksək effektivliyini bir də nümayiş etdirir.

Fermentativ reaksiyaların molekulyar mexanizmlərinə gəldikdə isə, onlar fermentin fəal mərkəzinin funksional qruplarının substartın məhsula çevrilməsində rolu ilə müəyyən olunur.