FəSİl IV. Fermentativ fəallığın təyini üsulları. Fermentlərin vahidləri

FƏSİL IV. Fermentativ fəallığın təyini üsulları. Fermentlərin vahidləri.

Fermentin mövcudluğunu onun kataliz etdiyi reaksiyanın sürətinə, yəni reaksiya məhsullarının toplanması və ya reaksiya substratının sərf olunması sürətlərinə əsasən müəyyən etmək olar. Bu məqsədlə kimyəvi, polyarimetrik, qazometrik, xromatoqrafik, viskozimetrik, spektroskopik kimi müxtəlif üsullardan istifadə olunur.

Kimyəvi üsul

Fermentativ fəallığın kimyəvi üsullar vasitəsilə təyini bu və ya digər qrupların, eləcə də fermentin təsiri nəticəsində məhlulda əmələ gələn və ya sərf olunan maddələrin miqdarca təyininə əsaslanır. Məsələn, β-fruktofuranozidaza (saxaraza və ya invertaza) fermentinə diqqət yetirək. Bu ferment saxarozanı bir molekul qlükoza və bir molekul fruktozaya parçalayır:

• 
  C₁₂H₂₂O₁₁₊ H₂O → C₆H₁₂O₆ + C₆H₁₂O₆
  

Məlumdur ki, saxarozanın hər iki qlikozid hidroksili birləşmiş vəziyyətdə olduğu üçün, o, fellinq məhlulunu reduksiya etmək qabiliyyətindən məhrumdur. Saxarozanın hidrolizi nəticəsində qlikozid hidroksillər arasındakı rabitə qırılır, və əmələ gəlmiş qlükoza və fruktozanın sərbəst karbinol qrupları hesabına fellinq məhlulu reduksiya olunur. Beləliklə, reaksiya getdikcə, yəni saxaroza monosaxaridlərə parçalandıqca, fellinq məhlulunun reduksiya olunma dərəcəsi də artır və bunun sayəsində biz fermentin təsirinin nə qədər effektivli olması haqda məlumat əldə edə bilərik.

Fellinq məhlulunun reduksiya olunmasına əsaslanan bu üsul eyni zamanda β-amilazanın fəallığının təyini məqsədilə də tətbiq oluna bilər. β-amilaza aşağıdakı reaksiyanı kataliz edir:

• 
  Nişasta + H₂O → Maltoza + Dekstrinlər
  

Maltozanın tərkibində bir sərbəst karbonil qrupu var ki, onun sayəsində, o, fellinq məhlulunu reduksiya edir. Beləliklə, amilazanın fəallığı maltozanın fellinq məhlulu vasitəsilə təyini yolu ilə qeydə alına bilər.

Proteolitik, yəni zülal və peptidlərin parçalanmasını kataliz edən fermentlərin fəallığının təyini məqsədilə də müxtəlif kimyəvi üsullardan istifadə olunur. Məsələn, dipeptidin dipeptidaza fermenti ilə hidrolizi nəticəsində iki molekul amin turşusu əmələ gəlir. Bu zaman peptid (-CO-NH-) rabitəsi su molekulunu özünə burləşdirərək parçalanır və sərbəst amin və karboksil qrupları əmələ gəlir. Bu səbəbdən dipeptidazanın təsirinin qeydə alınması üçün sərbəst karboksil və ya amin qruplarının təyinini mümkün edən istənilən üsuldan istifadə etmək olar. Adətən azad olmuş amin qruplarını Syorensenə görə formol titrləmə ilə təyin edirlər. Formol titrləmə zamanı tərkibində reaksiya məhsulları olan məhlul formalinlə işlənilir. Formalin sərbəst amin qruplarını birləşdirir və bu zaman karboksil qruplar azad olunur ki, onları da qələvi ilə titrləmək olar. Beləliklə, azad olunmuş karboksil qruplarının miqdarını təyin etməklə və müvafiq hesablama aparmaqla tədqiq olunan məhlulda sərbəst amin qruplarının miqdarını təyin etmək mümkündür.

Proteolitik fermentlərin fəallığının təyininin digər üsulu Vilştetter üsuludur. Bu üsulun mahiyyəti ondadır ki, reaksiya getdiyi məhlulun üzərinə müəyyən qatılıqlı spirt əlavə olunur. Tədqiq olunan məhlulda amin qruplarının dissosiasiyasının qarşısı alınır, azad olunmuş karboksil qrupları isə qələvi ilə titrlənir.

Yağın parçalanması reaksiyasına diqqət yetirək. Məlumdur ki, yağlar lipazalar adlanan fermentlərin təsiri ilə parçalanırlar və bu reaksiya aşağıdakı tənliyə müvafiq olaraq gedir:

burada R₁, R₂ və R₃ — müxtəlif yağ turşuların qalıqlarıdırlar.

Əgər lipaza ilə kataliz olunan reaksiya tam olaraq, yəni üç su molekulunun birləşməsi ilə baş versə, bu halda qliserin və üç molekul yağ turşusu əmələ gələcək. Bu reaksiyanın gedişini əmələ gələn sərbəst yağ turşuların miqdarına əsasən qeydə almaq olar. Bu məqsədlə müəyyən qatılıqlı qələvi ilə titrləmə aparılır.