Genetik injeneriya

Ushbu taqdimotda biz genetik muhandislik va biotexnologiyaning qiziqarli sohasini o'rganamiz, uning kelib chiqishi, qo'llanilishi, axloqiy oqibatlari va kelajak istiqbollarini ko'rib chiqamiz.
GENETIK INJENERIYA
VA BIOTEXNOLOGIYA
Ta'rif va Maqsad
Qisqacha tarix va rivojlanish
Genetik muhandislikning ma'nosini va uning hayotning turli tomonlarini yaxshilash uchun genetik materialni manipulyatsiya qilishdagi maqsadlarini bilib olish
DNK tuzilishining kashf etilishidan tortib, bugungi kunda mavjud bo'lgan inqilobiy gen tahrirlash usullarigacha bo'lgan genetik muhandislikdagi tarixiy bosqichlarni kuzatib borish
Genetik injeneriyasiga kirish
Ilovalar
Tibbiyot yutuqlari, qishloq xo'jaligini yaxshilash va sanoat innovatsiyalarini o'z ichiga olgan genetik muhandislikning keng ko'lamli ilovalarini o'rganish.
AXLOQIY VA IJTIMOIY OQIBATLAR
1
2
3
Biologik xilma-xillik va atrof-muhitga ta'siri
Ekotizimlarning nozik muvozanatiga va biologik xilma-xillikni saqlashga genetik muhandislikning potentsial ta'sirini ko'rib chiqing.
GMOlarning axloqiy mulohazalari
Munosabatlar va munozaralar
Genetik jihatdan o'zgartirilgan organizmlar (GMO) atrofidagi axloqiy savollarni, shu jumladan inson salomatligi va atrof-muhit uchun potentsial xavf va foydalarni o'rganing.
Jamiyatda genetik muhandislikni qabul qilish va tartibga solish bo'yicha turli xil munosabatlar va davom etayotgan munozaralarni ko'rib chiqing.
DNK
KETMA-KETLIGI
DNK ketma-ketligi
DNK ketma-ketligining kuchli texnologiyasini o'rganing, olimlarga genetik kodlarni ochish va qimmatli tushunchalarni ochish uchun yo'l xaritasini taqdim eting.
Gen tahrirlash texnologiyalari
CRISPR-Cas9 kabi ilg'or vositalar yordamida gen muhandisligi imkoniyatlarini tubdan o'zgartirib, aniq genlarni manipulyatsiya qilish dunyosiga sho'ng'ing.
Klonlash va genlarni uzatish
Organizmlarning bir xil nusxalarini yaratish yoki kerakli genlarni turli turlar o'rtasida o'tkazish uchun qo'llaniladigan usullar haqida bilib oling.
HOZIRGI MUAMMOLAR VA KELAJAK ISTIQBOLLARI
Normativ muammolar va xavfsizlik bilan bog'liq muammolar
Genetik muhandislik atrofidagi tartibga soluvchi landshaft va uni qo'llashda xavfsizlikni ta'minlash uchun ko'rilgan choralarni ko'rib chiqing.
Potentsial foyda va xavflar
Qisqa muddatli va uzoq muddatli ta'sirlarni hisobga olgan holda, genetik muhandislik sohasidagi yutuqlar bilan bog'liq potentsial afzalliklar va xavflarni tahlil qiling.
Kelajakdagi ilovalar uchun imkoniyatlar
Shaxsiylashtirilgan tibbiyotdan barqaror qishloq xo'jaligigacha bo'lgan genetik muhandislikning kelajagida bizni ajoyib imkoniyatlar kutayotganini tasavvur qiling.
GEN INJENERIYASI UCHTA BOSQICHDA OLIB BORILADI:
1. KERAKLI GENNI AJRATISH YOKI UNI
SINTEZ QILISH.
2. SHU KERAKLI GENI BO‘LGAN DNKNI KO‘CHIRUVCHI (VEKTOR) DNKSIGA ULASH.
3. KERAKLI GEN ULANGAN VEKTOR DNKSINI HUJAYRAGA YOKI ORGANIZMGA O‘TKAZISH.
Kerakli gen ulangan vektor DNKsini hujayraga yoki organizmga o‘tkazishning (transgenez) to‘rtta yo‘li bor:
1. transformatsiya;
2. transduksiya;
3. sodda hayvonlar, bakteriyalarning konyugatsiyasi va yuqori organizmlarni duragaylash;
4. transgressiya – hujayraga kirgan virusning genomga birikishi va undagi genlar
ta’sirining yuzaga chiqishi. Transformatsiya, transduktsiya, somatik hujayralarni duragaylash hodisalari bilan yuqorida to‘liq tanishgan edik.
Transformasiya-deb tashqaridan hujayra ichiga kiritilgan - begona DNK molekulasi ta’sirida organizmlar belgi va xususiyatlarining irsiy o`zgarishiga aytiladi.
Transformatsiya hodisasi 1928 yilda Grifits tomonidan kashf qilingan.
Transformasiyada irsiy belgini o`zgartiruvchi modda-DNK- dezoksiribonuklein kislota ekanligini 1944 yilda O. Everi, Mak-Leod, Mak-Karti degan olimlar aniqladilar.
Transformatsiya
Transformatsiya xodisasi 2 ta bakteriya qatnashadi, birinchisida DNK donor, ikkinchisida DNK retsepient bo'ladi. Lekin hamma hujayralar ham DNK ni qabul qilavermaydi. DNK qabul qilish xususiyatiga ega bo'lgan hujayrani kompetent hujayralar deyiladi.
Transformatsiya holatini chaqirish uchun ba'zan bakteriya hujayralari ayrim moddalar ta'sirida ishlanib, hujayra devorini o'tkazuvchanligi oshiriladi.
DNK donorni retsepietga adsorbsiyasi.
Donor DNK sini retsepientga hujayrasi ichiga kirishi.
Donor DNK sini retsepient xromasomasining o'ziga o'xshash qismi bilan birlashib rekombinatsiya hosil qilishi.
Transformatsiya jarayoni bir necha fazada o'tadi:
Transformatsiya amaliyotda quyidagi ahamiyatga ega:
- tabbiy sharoitlarda virulentlentlikni kuchayishiga olib keladi.
- bakteriya xromosomalarini kartasi(xaritasi)ni tuzib chiqishga yordam beradi;
- mikroorganizmlarning foydali shtammlarini yaratishda qollaniladi;
- transgen osimliklarning olishni bosqichlaridan biri bolib hisoblanadi;
- bakteriya genomiga ma’lum bir genlarning kiritishda qollaniladi;
Transduksiya
• Transduktsiya deb genetik materialning bir bakteriya hujayrasidan ikkinchisiga bakterio-faglar orqali o'tkazilishiga aytilib, bunda bakterial genlar bakteriofagning DNK siga hujayra lizisi davrida qo'shib olinadi va keyingi infektsiya davrida yangi qo'shib olingan bakterial gen boshqa bakteriyaga o'tkaziladi.
Transduksiya hodisasi 1952 yilda A. Xershi, M. Cheyz hamda J. Lederberg va N. Sinderlar tajribalarida tushuntirilgan.
Transduksiya xillari
Umumiy transduksiya
Maxsus (spetsifik)
Abortiv transduksiya
Tranduksiya xillar
• Umumiy (o'ziga xos bo'lmagan) transduksiya - bakterial xromosomaning biron bir qismining parchalanishini bakteriofagning virusli uzatilishi.
• Maxsus (spetsifik) - ma'lum bir DNK fragmentini o'rtacha fajli o'tkazish (fag DNK kiritilgan joyga ulashgan).
• Abortiv transduksiya - kiritilgan donor DNK bo'lagi qabul qiluvchi xromosoma bilan birlashmaydi, ammo sitoplazmada qoladi va u erda mustaqil ravishda ishlaydi.
Transformatsiyada prokariot organizm atrof-muhitdagi DNKni toʻgʻridan toʻgʻri oʻzlashtiradi (gomologik rekombinatsiya orqali prokariot organizm genomiga integratsiya boʻluvchi halqali plazmid yoki DNK fragmenti shaklida).
Transduksiya – virus ishtirokida DNKning bir prokariot organizm hujayrasidan boshqasiga oʻtkazilishi. Bakteriya hujayrasini zararlantirgan virus (bakteriofag) yangi virus zarrachalari hosil boʻlishi paytida tasodifan xoʻjayin hujayra DNKsini oʻzi bilan oladi va oʻzi zararlantiradigan keyingi bakteriya hujayrasiga oʻtkazadi.
Konyugatsiyada prokariot hujayra koʻpayish koʻprigi deb ataluvchi tuzilma orqali oʻz DNKsini toʻgʻridan toʻgʻri boshqa hujayraga oʻtkazadi, bu jarayonda ikkita hujayraning fiziologik oʻzaro bogʻlanishi talab etiladi.
Konyugatsiya - DNKning bir bakteriya hujayrasidan boshqasiga o'tkazilishi. Donor hujayra hujayra yuzasidagi kiprikchalar yordamida retsepiyent hujayraga yaqinlashganida, ular o'rtasida DNK almashinishi yuz beradi. Ko'p hollarda DNK plazmid ko'rinishida o'tkaziladi.Donor hujayralar donorlik vazifasini bajaradi, chunki ularda fertillik faktori (yoki F faktor) deb ataluvchi DNK boʻlagi mavjud. Mana shu DNK bo'lagi jinsiy kiprikchalarni hosil qiluvchi oqsillarni kodlaydi. Bundan tashqari, unda konyugatsiya paytida DNK o'tkazilishini boshlab beruvchi maxsus sayt ham mavjud.
Agar konyugatsiya paytida F faktor o'tkazilishi amalga oshsa, qabul qiluvchi (retsipiyent) hujayra kiprikcha hosil qiluvchi va boshqa hujayralarga ham DNK o'tkazuvchi F donor hujayraga aylanadi.
Konyugasiya – donor hujayrasi va resipient hujayrasini bir-biri bilan birlashishi va ular orasida konyugatsion ko'prikcha hosil bo'lishi natijasida irsiy axboratni biridan ikkinchisiga o'tkazilishi bilan sodir bo'ladigan genetik almashish jarayonidir.
Irsiy axboratni almashtirish usuli sifatida konyugatsiya quyidagi yo'nalishlarda qo'llaniladi:
1.Genetik markerlarning bir xil hujayradan boshqa xil hujayralarga o'tkazishda;
2. Konyugatsion chatishtirish usuli xromosomalarning xaritasini tuzishda qulay. Bakteriyalarda xromosoma xaritalari daqiqalarda tuziladi. Е. cоli bakteriyasida xaritani boshlanish nuqtasi bo'lib treonin va leysinning sinteziga javobgar bo'lgan genlarni joylashgan qismi hisoblanadi. Konyugatsiya jarayonida Е. cоli bakteriyasini hamma xromosomalari 100 minut ichida ko'chirib o'tkaziladi.
3. Bakteriyalarda genetik apparatni o'rganishda.
4. Tabiatda kon'yugasiya jarayoni tufayli bakteriyalarda o'zgaruvchanlik doimo sodir bo'lib turadi.
Irsiyatni organizm darajasida qayta tuzish. Yangi genetik usullarning paydo bo‘lishi bilan irsiyatni organizm darajasida qayta tuzish imkoniyati tug‘ildi. J.Gordon (1962) birinchilardan bo‘lib voyaga yetmagan baqaning (dumli davrida) epiteliy hujayra yadrosini yadrosi olingan baqaning tuxum hujayrasiga ko‘chirib o‘tkazdi (133 va 134-rasmlar). Bunday tuxum hujayradan embrion rivojlanib, yosh dumli baqa hosil bo‘ldi. U esa voyaga
yetgan baqaga aylanib, ko‘paya boshladi.
Yadrosiz tuxum hujayraga shu
organizmning somatik hujayra yadrosini
ko‘chirib o‘tkazish bilan genotipi bir xil
bo‘lgan organizmlarni olish mumkin.
Аgar shu usulni sut-emizuvchilarda
o‘tkazilsa, juda katta amaliy foydaga
erishish mumkin.
J.Gordan tajribasi
Ichak epiteliysi hujayrasining yadrosini baqaning urug‘lanmagan tuxum hujayrasiga ko‘chirib o‘tkazish va undan yetuk organizmning rivojlanishi.
Chunki qoramollar, qo‘ylar va boshqa qishloq xo‘jalik hayvonlari orasida sersut, seryog‘, serjun, go‘shtdorlar uchraydi. Jinsiy ko‘payish paytida bu yaxshi belgilar yuzaga chiqmasligi mumkin. Sermahsul hisoblangan bitta hayvon somatik hujayrasidan olingan diploid yadroni ko‘plab yadrosiz tuxum hujayralarga o‘tkazib, sermahsul hayvonlar sonini ko‘paytirish mumkin. Lekin bu usulni yuqori organizmlarda qo‘llash ancha noqulay, chunki ularning tuxum hujayrasi baqanikiga qaraganda juda kichik va baqanikiga o‘xshash otalanishi hamda rivojlanishi suvda kechmaydi, shuning uchun somatik hujayra yadrosini o‘ziga qabul qilgan tuxum hujayrani hayvonlarning bachadoniga o‘tkazish kerak bo‘ladi. Organizm darajasida o‘tkazilgan genetik injeneriyaga E. Mak-Lorenning allofen (organizmida har xil ota-onadan olgan, ya’ni har xil irsiy omili bo‘lgan organizmlar) sichqonlarni yaratish tajribasini ko‘rsatish mumkin. Embrioni 8 ta blastomera holatida bo‘lgan organizm embrioniga pronaza fermentini ta’sir ettirib, blastomerlarini alohida-alohida qilib ajratiladi. Shu usul bilan bir-biridan ajratilgan bitta sichqonning embrion blastomerlari boshqa sichqonning shu yo‘lda ajratilgan blastomerlariga qo‘shiladi va ulardan yaxlit embrion olinadi.
Qora va oq sichqonlar blastula hujayralarining aralashmasidan alloffen sichqonlarni olish.
Oq va qora sichqon blastomerlarining qo‘shilishidan olachipor (allofen) sichqonning paydo bo‘lishi ko‘rsatilgan. Qora va oq sichqonlar blastomerlarining birga qo‘shilishidan hosil bo‘lgan murtakni gastrulatsiya davrida probirkadan qiz sichqonning bachadoniga ko‘chirib o‘tkazildi. Shu murtakdan rivojlangan sichqon bolasida har ikki ota-onaning ham genetik xususiyatlari paydo bo‘lib, rangi olachipor bo‘ladi. Аllofen sichqonlarni 3 ta, 4 ta va undan ham ortiq organizmlar embrionining blastomerlarini qo‘shib ham olish mumkin.
Irsiyatni populyatsiya darajasida qayta ko‘rish. Hozirgi kunda tibbiyotdagi ko‘pgina jarayonlar (tibbiy-genetik maslahat, yosh bolalarning o‘limiga qarshi kurash, odamlarda tug‘ilishni boshqarish va boshqalar) odam populyatsiyalari genofondiga ta’sir ko‘rsatmoqda. Аngliyada 1978-yili P. Stentou va R. Edvardslar probirkada tuxum hujayralarni urug‘lantirib, shu urug‘langan hujayrani uch kundan keyin ayol bachadoniga ko‘chirib o‘tkazdilar. Oradan to‘qqiz oy o‘tgach, onadan sog‘lom qizaloq tug‘ildi. Hozirgi kunda faqat АQSHning o‘zida har yili 25 mingga yaqin farzandsiz ayollar sun’iy urug‘lantiriladi va ulardan 10 mingga yaqini farzandli bo‘lmoqda. Buning uchun sog‘lom erkaklardan urug‘ olinib, maxsus idishlarda saqlanadi. Bu masalalar metodik tomondan yaxshi hal qilingan bo‘lsada, uning etika masalalari yechilgan emas (masalan, urug‘ni kimdan olish kerak va hokazo). Lekin tibbiy-genetik maslahatlar tufayli irsiy kasalliklarning oldi olinmoqda.
G.Fink bakteriyadagi leytsin aminokislotasini hosil bo‘lishini boshqarib turuvchi
genni shunday geni bo‘lmagan zamburug‘ hujayrasiga o‘tkazdi. 1971-yili amerikalik olimlar K.Merril, M.Gayyer va Dj.Petricheli - ichak bakteriyasidagi galaktoza-1-fosfat-uridil-transferaza genini sun’iy o‘stirilayotgan odam hujayralariga o‘tkazdilar. Bu bilan olimlar moddalar almashinuvini buzilishiga olib keladigan og‘ir tug‘ma kasalliklarni davolash uchun yo‘l ochdilar. Hozirgi kunda ayrim genlarni sintez qilishning bir qancha usullari ishlab chiqildi. Masalan, quyonning qizil qon tanachalaridan poliribosomalar, ulardan esa globin i-RNKsi
(gemoglobinning oqsil qismi) ajratib olindi. Shundan keyin DNK polimerazaning
RNK – tobe virus fermenti yordamida birinchi bo‘lib ana shu i-RNKning DNK
nusxasini sintez qildilar
Irsiy kasalliklarni davolashda har xil biologik faol moddalar kerak bo‘ladi. Аgar
bu moddalar odamning o‘zidan olinsa, odamlarga har xil viruslarning yuqish xavfi
tug‘iladi. Masalan, gemofiliya kasalligini davolash uchun odam qonidan ishlab
chiqilgan dorilar tarkibidan SPID kasalligining virusi topilgan. Biologik faol
moddalarni hayvon hujayrasidan olinib keyin odamga yuborilsa, retsipientning
immunologik tizimi bu moddalarni qabul qilmasligi mumkin. Shuning uchun bu
biologik faol moddalar faqat odamniki bo‘lishi kerak. Buni genetik injeneriya
usullari yordamidagina hal qilish mumkin.
Hozirgi kunda gen injeneriyasi usullaridan foydalanilgan holda tibbiyotda
ishlatiladigan o‘nga yaqin oqsillar sintez qilinmoqda (insulin, o‘stiruvchi gormon,
interferon, interleykin, profirinolizinni faollashtiruvchi oqsil, B-gepatitga qarshi
vaksina, yashur kasalligiga qarshi vaksina, α-antitripsin, gemofiliya kasalligini
davolashda ishlatiladigan IX va VIII qon omillari). Gen injeneriyasidan yana
tibbiyotda irsiy kasalliklarni aniqlashda ham foydalaniladi. Normadagi genning
nukleotidlar tartibini bilgan holda, u o‘zgarganda undagi nukleotidlarni joylashish
tartibining o‘zgarishi aniqlandi.
GENLARNI TAHRIRLASH USULLAR
Genlarni tahrirlashning zamonaviy usullari
Genomni tahrirlash quyidagilar yordamida amalga oshiriladi:
- kimerik oligonükleotidlar;
- meganukleazlar,
- ZF yadrolari,
- TALE yadrolari,
- CRISPR/Cas texnologiyalari,
- sun'iy molekulyar qaychi ARCUT.
Kimerik oligonükleotidlar yordamida birinchi mutagenez 1999 yilda amalga oshirilgan.
Shuni ta'kidlash kerakki, oligonukleotid konstruktsiyalari yordamida mutagenezning turli xil o'zgarishlari mavjud.
Biroq, ushbu yondashuvdan foydalanish istiqbollari kichik, chunki:
- mutatsiyalarni kiritish jarayonining past samaradorligi;
- kerakli o'simliklarni tanlashda jiddiy qiyinchiliklar.
Shuningdek, genomik tahrirlash usullaridan biri bu DNKdagi ikki zanjirli
uzilishlardan, shuningdek, meganukleazlardan foydalanishdir.
Rekombinatsiyaning eng yuqori samaradorligi uchun maqsadli DNK mintaqasiga
ikki zanjirli uzilishlarni kiritish talab qilinadi, buning uchun meganukleazlar mos
keladi. Ikki zanjirli uzilish tufayli, rekombinatsiya tufayli yangi DNK segmentini
genomning ma'lum bir joyiga kiritish juda oson.
ZF nukleazlari yordamida genomni tahrirlash xususiyatlariga to'xtalib o'tamiz. Shunday qilib, DNK molekulasidagi ikki zanjirli uzilishlar rekombinatsiya samaradorligini sezilarli darajada oshiradi, shuning uchun bunday uzilishlar yaratilishi kerak. Yuqori samaradorlik uchun kimerik nukleazadan foydalanish taklif etiladi. Bunday holda, "sink barmoqlari" tanib olish maydoni sifatida
ishlatiladi. Shunday qilib, ularni FokI cheklash fermentining katalitik sohasi bilan birlashtirib, ular aslida ZF yadrosiga aylandi. Shuni ta'kidlash kerakki, ZF genomini tahrirlashning eng qiyin qismi nukleotidlar ketma-ketligiga xos bo'lgan sink barmoqlarini qurishdir. Genomni tahrirlashning yana bir usuli - TALEN texnologiyasi. Turli organizmlarning genomlariga maqsadli mutatsiyalarni kiritishning soddaligi va yuqori samaradorligi bilan tavsiflanadi. Bu texnologiya TALE nukleazasidan foydalanishga asoslangan. Shuni ta'kidlash kerakki, TALEN texnologiyasidan foydalangan holda genomni tahrirlashning eng yuqori samaradorligi uchun tahrirlash saytlarini qidirish, genetik muhandislik konstruksiyalarini loyihalash va maqsadli bo'lmagan saytlarni aniqlash uchun mo'ljallangan bir qator kompyuter dasturlari yozilgan. Bundan tashqari, shuni ta'kidlaymizki, CRISPR/Cas genomlarini tahrirlash texnologiyasi boshqalardan sezilarli ustunligi tufayli hozirda ustunlik qilmoqda. Shunday qilib, uning asosiy afzalliklari tayyorgarlik protseduralarining nisbatan soddaligi va tezligidir. Shu bilan birga, genomga kiritilgan o'zgarishlarning aniqligi ushbu texnologiyaning turli xil takomillashuvlari tufayli ancha yuqori. Keyinchalik, genomlarni tahrirlash uchun ARCUT sun'iy molekulyar qaychidan
foydalanishga e'tibor qaratamiz.
Shunday qilib, ba'zi mualliflar ARCUTni ZFN genomik tahriri,shuningdek,
meganukleazlardan foydalanish bilan solishtirishadi. Biroq, genomlari shu tarzda
tahrirlangan yangi organizmlar hali olinmaganligi aniqlandi
Zinc-finger texnologiyasi.Fok I – endonukleazalar domeni bilan bog‘langan oqsil domeninig “Rux barmoqchalari” tipi sayt-spetsifik nukleaza sifatida faol bo‘lib DNKni in vitro sharoitida qat’iy belgilangan uchastkalarini o‘ta aniqlikda qirqishi allaqachon 1996 yilda birinchi marta ko‘rsatib berilgan edi. Shu kabi ximerik oqsillar modulli strukturaga ega bo‘lib har bir “rux barmoqchalari” domeni bir nukleotid tripletini taniydi (Zinc-finger Nuclease, ZFN).1 Bu kulturalanadigan xujayralar jumladan plyuripotent tana xujayralari hamda model hayvonlar va o‘simliklarda asosiy tahrirlash usuliga aylandi.2 Ammo ZFN texnologiyasi murakkabligi va har bir aniq genom lokuslari uchun oqsil domenlarining konstruksiyasini tuzishga yuqori harajat talab etilishi, bir nukleotidli almashinuv yoki domenlar aro o‘zaro noto‘g‘ri ta’sirlar sababli DNK-nishonning noaniq qirqilishi ehtimolliklari kabi bir nechta kamchiliklarga ega.3 Shuning uchun genomni tahrirlovchi yangi texnologiyalar topish maqsadida faol izlanishlar davom etdi. So‘nggi yillarda bu izlanishlar genomlarni tahrirlash imkonini beruvchi yangi instrumentlarning yaratilishiga sabab bo‘ldi. TALEN texnologiyasi. Bu tizimlar – TALEN (Transcription Activator- Like Effector Nucleases, ya’ni transkripsiyani faolllashtiruvchilarga o‘xshash effektor nukleazalar) va CRISPR/Cas9 (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats, ya’ni - muntazam bir-biridan bir xil uzoqlikda joylashgan qisqa palindromik guruxlar takrorlari).5 Ushbu tizimlar odam, o‘simliklar va hayvonlar xujayrasida yuqori samarali ishlarni amalga oshirish va ular uchun konstruksiyalar tuzishning nisbatan soddaligi bilan farq qiladi. Bu kabi texnologiyalar genomlar ustida turli xil manipulyatsiyalarni amalga oshirishda faol qo‘llanilmoqda va bu orqali transgen va mutant hayvon va o‘simliklar yaratish hamda kulturalanadigan odam plyuripotent xujayralari asosida kasalliklar modelini yaratish va tadqiq etish kabi bir qator murakkab muammolarni hal etish uchun imkon yaratadi. Bundan tashqari epigenomikasini o‘rganish va xromosoma lokuslarini xujayra siklida o‘tkazish uchun TALEN DNK- bog‘lovchi domenlari asosidagi ximerik oqsillar va faoliyati to‘xtatilgan (inaktivatsiya) Cas9 nukleazalaridan genlar transkripsiyasini boshqarish bo‘yicha olib borilgan tajribalarda foydalanilgan.
2011 yilda genomlarni yuqori darajadagi aniqlikda tahrirlash imkonini beruvchi usullar qatorida TALEN tizimi ham nufuzli “Nature Methods” halqaro jurnali tomonidan yil texnologiyasi deb tan olindi. Bu texnologiyaning yaratilish tarixi Xanthomonas avlodi bakteriyalarining o‘rganilishi bilan bog‘liq. Ushbu bakteriyalar sholi, qalampir, pomidor kabi o‘simliklarning patogeni hisoblanib qishloq xo‘jaligiga katta iqtisodiy zarar keltiradi, bu esa ularning sinchkovlik bilan o‘rganilishiga sabab bo‘ldi. Aniqlanishicha, bakteriyalar o‘simliklar xujayralarining sitoplazmasiga effektor oqsillarni (TALE, Transcription Activator-Like Effectors) ajratib chiqaradi, bu esa o‘simliklar xujayrasidagi jarayonlarga ta’sir etib patogenlarga nisbatan chalinuvchanlik darajasini oshiradi. Keyinchalik effektor (ta’sir etuvchi) oqsillarning faoliyat mexanizmlarini o‘rganish natijasida, ular eukariotlardagi transkripsiya omillarini takrorlab DNK bilan bog‘lana olish va o‘zlarining gen-nishonlarining ekspressiyasini faollashtirish qobiliyatiga ega ekanligi aniqlandi.
TALE oqsillari DNKga bog‘lanishi, domen va yadroda joylashish signali hamda maqsaddagi genning transkripsiyasini faollashtirish uchun javobgar markaziy domendan tashkil topgan.
Birinchi marta ushbu oqsillarning DNKga bog‘lana olish qobiliyatlari 2007 yilda tavsiflangan edi, bir yil o‘tib esa ikki gurux olimlar tomonidan TALE oqsillarining nishonlangan DNK izchilliklarini tanib olish kodlari aniqlandi.1 DNKga bog‘lanuvchi domen monomerlardan tashkil topganligi va ularning har biri bitta nukleotid bilan nishonlangan nukleotid ketma-kemligiga bog‘lanishi ko‘rsatib berildi. Monomerlar ikkitasi yuqori o‘zgaruvchan (Repeat Variable Diresidue, RVD) 12 - va 13- pozitsiyalarda joylashgan 34 aminokislotalar qoldig‘idan iborat tandem takrorlarni namoyish etadi.2 Bunda aynan o‘sha yuqori o‘zgaruvchan aminokislotalar belgilangan nukleotidlarni tanib olishga javobgar hisoblanadi. Bu kod tug‘ma (degenerativ virojdenniy) hisoblanadi. Ba’zi yuqori o‘zgaruvchan aminokislotalar bir necha nukleotidlar bilan turli samaradorlik bilan bog‘lanishi mumkin. Bunda TALE monomerlari bog‘lanadigan 5’- oxir nukleotid ketma-ketligi oldidan nishonlangan DNK molekulasida doim faqat timidin nukleotidi joylashgan bo‘ladi, bu esa bog‘lanish samaradorligiga ta’sir etadi.3 So‘nggi 3’-uchi tanib olish saytiga bog‘lanuvchi tandemli takror 20 aminokislota qoldig‘idan iborat bo‘lib u yarim takror deb nomlanadi. TALE oqsillari yordamida DNK kodlarining o‘qilishi aniqlanganidan so‘ng o‘zining soddaligi (bir monomer- bir nukleotid) bilan butun dunyo olimlarining qiziqishini uyg‘otdi va TALEN - ximerik nukleazalar yaratish bo‘yicha birinchi tajribalar amalga oshirildi.4 Shu maqsadda TALE domeniga bog‘lanib DNKni kodirlovchi izchillikni plazmida vektoriga kiritildi, bu vektor ilgari ZFN texnologiyasini yaratishda foydalanilgan. Natijada DNKga bog‘lanuvchi domenni va FokI restriksiyalari endonukleazalarining katalitik domenini o‘z ichiga olgan sun’iy ximerik nukleazalar ekspressiya qiluvchi genetik konstruksiyalar yaratildi. Bu texnologiya DNK-bog‘lovchi domen turli yuqori o‘zgaruvchan monomerlarni (Repeat Variable Diresidue, RVD) birlashtirgan holda istalgan nukleotid ketma-ketligi nishon bo‘lgan sun’iy nukleazalar yaratish imkonini beradi. Ko‘p hollarda A, T, G, C nukleotidlarini mos ravishda bog‘lash uchun Asn va Ile (NI), Asn va Gly (NG), ikki Asn (NN), His va Asp (HD) larni o‘z ichiga olgan yuqori o‘zgaruvchan (RVD) monomerlardan foydalaniladi. Bunda yuqori o‘zgaruvchan monomerlar-RVD NN, A hamda G sifatida bog‘lanishi mumkin. Ko‘plab tajribalarda guaninning yanada spetsifikroq bog‘lanishi uchun NH yoki NK monomerlari qo‘llanilganida keraksiz nishonga bog‘lanish xatoliklarini kamaytiradi. Yuqori o‘zgaruvchan monomerlardagi-RVD (H yoki N) birinchi aminokislota qoldig‘i bevosita nukleotidga bog‘lanishda qatnashmaydi, lekin fazoviy konformatsiyani stabillash uchun javob berishi aniqlandi. Ikkinchi aminokislota qoldig‘i nukleotid bilan o‘zaro bog‘lanadi, bunda bog‘lanish tabiati turlicha: D va N azotli asoslar bilan vodorod bog‘larini hosil qiladi, lekin I va G Van-der-Vaals kuchi hisobiga nishonlangan nukleotidlar bilan bog‘lanadi.1 Domenga bog‘lanuvchi sun’iy DNK yadro lokalizatsiyasi signaliga, N- uchi domeni va FokI katalitik domeniga ega bo‘lgan yarimtakror genetik konstruksiyaga kirgiziladi. Sun’iy nukleazalar uchun ishonlangan saytlar quyidagicha tanlab olinadi: ular DNKning turli zanjirlarida bo‘lishi va speyser ketma-ketligida kichik uchastkalarga (12-25 j.n.) ajratilgan bo‘lishi kerak bo‘ladi. Sun’iy nukleazalarning yadroga borib joylashishi bilan ular nishonlangan saytlar bilan bog‘lanadi, natijada S uchlarida joylashgan ximerik oqsillarning FokI domenlari dimerizatsiyalanadi va speyser ketma- ketligiga ikki zanjirli bo‘shliq hosil qiladi.
Biotexnologiya. 1970-yillarda molekular genetika, hujayra biologiyasi va kimyosi yutuqlariga asoslangan ishlab chiqarish usuli – biotexnologiya paydo bo‘ldi. Lekin biologik usulda ishlab chiqarish jarayoni qadim zamonlardan bizga ma’lum. Masalan, non, vino, sut mahsulotlari, pishloq ishlab chiqarish, bijg‘itish, tibbiyotda ishlatiladigan dorilarni ishlab chiqarish va boshqalar biotexnologik jarayonlar bo‘lib, boshqa ishlab chiqarish usullariga qaraganda energiya va xomashyoni ko‘p talab qilmaydi. Biotexnologiyaning yana bir qulaylik tomoni shundaki, bu jarayon natijasida hosil bo‘lgan chiqindilar kam va ular albatta yana bir boshqa maqsadlar uchun ishlatiladi. Biotexnologiya keyingi yillarda genetik injeneriyaning yutuqlariga suyangan holda yanada rivojlanmoqda. DNK molekulasini ishlab chiqaruvchi tarmoqlar yaratila boshlandi. Shunday tarmoqlar dastlab 1976-yili Аmerikada, keyinchalik esa Yevropada va Yaponiyada paydo bo‘ldi. Biotexnologiya jarayonlaridan mikrobiologiya sanoati, o‘simlik va hayvon seleksiyasida fermentlar ishlab chiqarish sanoati, oziq-ovqat sanoati, tibbiy doridarmonlar ishlab chiqarish va boshqa sohalarda keng qo‘llanilmoqda. Hozirgi kunda biotexnologiya usullari asosida ko‘plab (4500 ga yaqin) antibiotiklar olish yo‘lga qo‘yilgan.