Hemositometrik yöntem ile eritrosiT, LÖkosit ve trombosit sayisinin saptanmasi eritrosit Sayısının Saptanması



Yüklə 47.28 Kb.
tarix03.04.2017
ölçüsü47.28 Kb.

HEMOSİTOMETRİK YÖNTEM İLE ERİTROSİT, LÖKOSİT VE TROMBOSİT SAYISININ SAPTANMASI

4.1. Eritrosit Sayısının Saptanması


Araç ve gereçler: Hemositometre ve sulandırma pipetleri, Toisson, Hayemçözeltisi ya da serum fizyolojik.

Metodun Uygulanması: Lanset ile parmak ucu delinir, ilk damla kan silinir. İçinde kırmızı boncuk olan eritrosit sulandırma pipeti (alkolle iyice temizlenmiş olmalı) alınır. Eğik tutularak kanın olduğu bölgeye ucu değdirilir. Kapillarite yolu ile kanın pipette 0,5 ya da 1 çizgisine kadar ilerlemesi sağlanır. Gerekirse ağızlık aracılığı ile kan çekilebilir. Ancak arada hava kalmamasına dikkat edilmelidir. Eritrosit sayısının az olduğu tahmin edilen kişilerde 1 çizgisine kadar, çok olduğu ya da normal olduğu düşünülen kişilerde 0,5 çizgisine kadar kan çekilmeli (Şekil 13), fazlası kurutma kâğıdına emdirilerek atılmalıdır. Daha sonra pipete 101 çizgisine kadar Toisson ya da Hayem (Tablo 1) çözeltisi çekilmelidir.

Eğer kan 0,5 çizgisine kadar çekilmiş ise ki genelde bu uygulanır, Hayem çözeltisi ile kan 100/0.5=200 kez sulandırılmış olur. Yani pipete alınan kanda eritrositler normalin 1/200 ü olmuştur. Pipetin ağızlık ucu parmak ile kapatılarak aşağı yukarı eğilmek sureti ile kan ile solüsyonun karışımı sağlanır. Hemositometre kutusu içinde bulunan Thoma lamı alınır (Şekil 2), üzerinde bulunan iki yandaki çıkıntılar hafifçe ıslatılır. Lamel bunların arasını kapatacak şekilde oturtulur. İki elin başparmakları ile konsantrik Newton halkaları belirinceye kadar bastırılır. Sulandırma pipeti üflemek sureti ile ilk iki damlası atılır (kan ile karışmamış olduğu için), sonra bir damla lam- lamel arasına sayım kamaralarının olduğu kenardan damlatılır. Bu sıvı kapillarite nedeni ile lam üzerinde bulunan sayım alanına yayılır. Aktarılan sıvının hareketsizleşmesi için 1–2 dk. beklenir. Önce mikroskobun diyaframı kapatılır küçük büyütmesinde (20x) sayım yapılacak olan çizgili alan bulunur. Daha sonra karelere düşen eritrositleri saymak amacı ile büyük büyütme (40x) ile bakılır.



Sayım Alanının Yapısı: Aşağıdaki şekilde görüldüğü gibi küçük büyütme ile bakılan alan, kenarları 1 mm olan karedir. Bu karenin her bir kenarında 4 büyük kare vardır, bunlar 3’erli çizgi ile diğer karelerden ayrılmışlardır. Bu herbir 3’erli çizginin işgal ettiği boyut küçük kare kenarını oluşturacak boyuttadır. 1 mm'lik kenar boyunca 4adet 3'lü çizgi bulunur. Bu 4 adet 3'lü çizginin biraraya geldiği varsayılırsa bir büyük kare kenarını oluşturur. O halde bir kenar (1 mm'lik boyut) boyunca 5 adet büyük kare kenarı yerleşmiştir. Bu nedenle her bir büyük kare kenarı 1/5 mm olur. Bir büyük karenin alanı da l/5x 1/5= 1/25 mm2 dir. Standart olarak, kapatılan lamel ile lam çizgileri arasındaki yükseklik 1/10 mm'dir. Sonuçta büyük karenin hacmi 1/25 x 1/10= 1/250mm3 olur, diğer bir söyleyiş ile mm3'ün 250'de biridir (Şekil 14).

Burada 5 büyük karede sayım yapılacağı için bu bulduğumuz hacmi 5 ile çarparız. Daha sonra amacımız 1 mm3 teki eritrosit sayısını bulmak olduğu için doğru orantıdan 50 çarpanını buluruz.



Mikroskopta büyük büyütme ile 5 ayrı yerdeki büyük karenin eritrositleri sayılır. Bir büyük karede 16 küçük kare olduğu için toplamda 16x5=80 küçük karede sayım yapılır. Bu sayım Thoma lamının her iki tarafındaki sayma kamarasında da yapılıp iki sayımın ortalaması alınır. Daha sonra da çıkan sayı sulandırma oranı 200 ve de 50 ile çarpılır. Örneğin 80 küçük karede 450 eritrosit sayılmış ise 450x10.000=4.500.000 eritrosit mm3 kanda var demektir.

Tablo 1: Çözeltiler


Toisson ve Hayem

Çözeltileri




İçindekiler

Toisson

Hayem

Sodyum Sülfat

8g

5g

Sodyum Klorür

1g

1g

Civa klorür

-

0.5 g

Gliserin

30 ml



Metil Menekşesi

0.025 g

-

Distile Su

160 ml

200 ml























Şekil 13: Eritrosit sulandırma pipetleri(değişik sulandırma oranları)



Şekil 14:Thoma sayım alanının şematik yapısı
Eritrosit sayısının fizyolojik değerleri:

Yetişkin erkekte : 4,5-6 milyon\ mm3 Artmasına Polisitemi denir.

Yetişkin kadında : 4-5,5 milyon\ mm3 Azalmasına Anemi denir.

Yenidoğanda : 6 milyon\ mm3


4.2. Lökosit Sayımı


Deneyin Amacı:

1mm³ kanda bulunan lökosit sayısını hesaplamaktır.



Gerekli Malzemeler:

1.Mikroskop: Bu deneyde 10’luk ve 40’lık büyütmeler kullanılacak, immersiyon yağı ile kullanılan 100’lük büyütme ise kullanılmayacaktır.

2. Turck Solüsyonu: Bu solüsyon içinde bulunan asetik asit sayesinde eritrositler ortadan kalkar ve sadece lökositler kalır. Yine bu solüsyon içinde bulunan metilen mavisi ile de lökositlerin çekirdekleri hafif boyanmış olarak görülürler. Böylece lökositleri saymak daha kolay hale gelir.

Bu solüsyonun içinde bulunan maddeler aşağıda belirtilmiştir.



Turck Solüsyonu

Lökosit Sayımı İçin

Asetik asit (%1’lik)

3cc

Metilen Mavisi

15-20 mg

Distile Su

300cc


kan pipetleri

Şekil 15: Eritrosit ve lökosit pipetleri

3. Lökosit sulandırma pipeti: Şekilde de görüldüğü gibi, bu pipet üzerinde; 0,5, 1 ve 11 çizgileri vardır. Pipetin 1 ve 11 çizgileri arasında kalan kısmında bir balon vardır. Burada kan turck solüsyonu ile karıştırarak sulandırılır. Balon içinde bulunan beyaz boncuk, kanın solüsyon ile karışmasını kolaylaştırmak içindir.

Deney sırasında 0,5 çizgisine kadar kan çekilip, turck solüsyonu ile 11 çizgisine tamamlanırsa, kan 20 kat sulandırılmış olur. Eğer 1 çizgisine kadar kan çekilip, turck solüsyonu ile 11 çizgisine tamamlanırsa, bu seferde 10 kat sulandırılmış olur. (biz daha çok 10 kat sulandırmayı kullanmaktayız.)



4. Sayma Lamı (Thoma veya Neubauer):



Şekil 16: Thoma lamı

Thoma Lamı: Şeklini gördüğümüz Thoma lamı, özel olarak hazırlanmış, üzerinde mikroskobik olarak görülebilen enine ve boyuna çizgilerin sınırladığı alanlar bulunan bir lamdır. Şekilde görüldüğü gibi, Thoma lamına yandan bakılacak olursa, üzerine lamel kapatıldığında lam ile lamel arasında bir boşluk kaldığı görülür. Lam ile lamel arasındaki bu boşluğun kalınlığı 1/10 mm’dir.

http://www.med.gazi.edu.tr/egitim/donem2/dersler/d2fizyoderbas_dosyalar/image006.gif

Şekil 17: Sayım kamarasının görünümü.

Bu lam üzerinde her biri 1mm² olan 2 tane sayma alanı vardır. Şekilde görülen en büyük karenin alanı 1mm²’dir. Bu alan, birbirine yakın çizilmiş enine ve boyuna üçlü çizgilerle 4x4=16 eşit kareye bölünmüştür. Bu 16 karenin her birine büyük kare adı verilir ve bu karelerin kenar uzunlukları, üçlü çizgilerden dışarıda bulunanlar esas alınarak hesaplanır. Dolayısıyla bu 16 kareden her birinin kenar uzunluğu ¼ değil 1/5 mm olur. Çünkü üçlü çizgiler de bir yer kaplamaktadır ve üçlü çizgilerin her birinin kalınlığı da 1/20 mm’dir.

Üçlü çizgilerle 16 eşit parçaya ayrılmış olan bu kareler, bu defa tekli çizgilerle tekrar 16 eşit kareye ayrılırlar ve her bir karenin kenar uzunluğu da 1/5x1/4=1/20 mm’dir. Görüldüğü üzere, bu karelerin kenar uzunluğu, üçlü çizgilerin kalınlığı ile aynıdır.

5. Lamel: Sayım yapılabilmesi için Thoma lamının üzerine bir lamel kapatılmalıdır. Thoma lamının sayım alanlarının kenarlarında bulunan sütunlardan dolayı, lamel kapatıldığında lam ile lamel arasında 1/10 mm kalınlığında bir boşluk kalmaktadır.

6.Alkol, pamuk: Delinecek bölgenin temizlenmesi amacıyla %70’lik etil alkol bir pamuğa emdirilir ve bölge temizlenir.

7.Lanset: Lansetin steril olduğundan emin olunmalı, delme işleminden önce lansetin uç kısmına dokunulmamalıdır. Lanset bir defa kullanıldıktan sonra atılmalı, başka bir kimsede tekrar kullanılmamalıdır.

Deneyin Yapılışı:

İlk önce kan alacağımız kişi oturtulmalıdır. Delmek istediğimiz parmak ucunun iç yüzü alkollü pamukla temizlenmelidir. Delmek için kullanacağımız lansetin steril olduğuna emin olmalı, lanseti yalnızca tek bir kişide kullanıp atmalıdır.

Parmağı deldikten sonra çıkan ilk damlayı, kuru bir pamukla siliyoruz. Çünkü ilk çıkan damla sonrakilere göre daha çabuk pıhtılaşır ve hücre bakımından da daha zengindir.

Lökosit pipetini elimize alıp pipeti yatay tutarak kan damlasına daldırıyoruz. Pipetin emici kısmından emerek 0,5 veya 1 çizgisine kadar kan çekiyoruz. Pipetin dışındaki kanı pamukla silmeliyiz. Bunu yaparken de pipetteki kan sütununun çektiğimiz işaretten aşağı düşmemesine dikkat etmeliyiz.

Pipette kan çekme işlemi tamamlandıktan sonra emici kısmı ağzımızdan çıkarabiliriz. Pipeti yatay tuttuğumuz zaman kan sütunu aşağıya kaymayacaktır. Pipeti yatay tutarak getirip turck solüsyonuna daldırıyoruz ve çekerken balon kısmına gelince pipeti dik pozisyona getiriyoruz. 11 çizgisine kadar solüsyon çekiyoruz. Tam 11 çizgisine geldiğinde pipetin arka ucunu elimizle kapatıp, pipeti yatay pozisyona getirerek solüsyonun içinden çıkarıyoruz.

Pipetin iki ucunu baş ve orta parmaklarımızla kapatarak bir iki dakika kadar çalkalayıp lökositlerin homojen olarak dağılmasını sağlıyoruz

Thoma lamının şekilde gösterildiği gibi sayım alanının her iki tarafında bulunan kısımlarını sulandırma solüsyonu veya başparmağımızın nemiyle hafifçe ıslattıktan sonra lameli bastırarak kapatıyoruz.

Pipetteki lökosit süspansiyonunun ilk birkaç damlasını dışarı akıtmalıyız. Çünkü pipetin ucundan 1 çizgisine kadar olan kapiller kısmında kan ile solüsyonun karışması gerçekleşmez. Buradaki solüsyonun atılması gereklidir.

Pipetin ucunu, sayım alanının bulunduğu bölmenin üzerindeki lamelin kenarına değdirerek, çok ufak bir damlayı lam ile lamel arasına bırakıyoruz. Bu sıvı, kapillerite nedeniyle lam ile lamel arasına yayılacaktır. Sıvı, set kısımlarına geçmemelidir. Aksi halde sayım alanı üzerindeki yükseklik artar ve hacim değişir. Sıvı lamelin üzerine de taşırılmamalıdır.

Lamı mikroskoba yerleştiriyoruz ve eğer sıvı hareketi varsa bir iki dakika bekliyoruz. İlk önce 10’luk büyütme ile bakarak sayma alanını buluyoruz ve sayımı yapabilmek için 40’lık büyütmeye geçiyoruz.

Lökosit sayımında 1mm²’lik sayma alanının tamamında bulunan lökositler 40’lık büyütme kullanılarak sayılır. 40’lık büyütmede bakıldığında 1mm²’lik alanın bütünü görülemeyeceği için, ilk önce sol üst büyük kareden başlayarak sağa doğru 4 büyük kare sayıldıktan sonra, kalınan noktadan alt satıra geçilir ve bu sefer de büyük kareler sağdan sola doğru ilerleyerek sayılır. Böylece devam edilerek 1mm²’lik alandaki lökositler sayılmış olur.

Lökosit Sayısının Hesaplanması:

1mm²’lik alandaki tüm lökositleri sayıyoruz.

Daha sonra 1mm²’lik sayma alanı üzerinde bulunan hacmi hesaplıyoruz.

(Hacim= En x Boy x Yükseklik)

(1x1x1/10=1/10 mm3)

1mm²’lik alan üzerindeki hacim hesaplandıktan sonra, basit bir orantı ile 1mm³ sulandırılmış kandaki lökosit sayısı hesaplanabilir.

Bulduğumuz değer, sulandırılmış kandaki lökosit sayısını gösterdiğinden, normal kandaki lökosit sayısını bulmak için sulandırma oranımızla çarpıyoruz. Eğer 0.5 çizgisine kadar kan çekilip 11’e tamamladıysak 20 ile, eğer 1 çizgisine kadar kan çekip 11’e tamamladıysak 10 ile çarpıyoruz. Bulduğumuz bu değer 1mm³ kandaki lökosit sayısını ifade etmektedir.

1mm³ kandaki lökosit sayısının fizyolojik değerleri aşağıdaki tabloda gösterilmiştir.



Lökosit sayısının fizyolojik değerleri




Yetişkinlerde

4000–10.000/mm³

Yeni doğanda

12.000–18.000/mm³


Lökositoz: 1mm³ kanda lökosit sayısının 10.000’in üzeride olmasıdır. Lökositoz durumunda kanda hangi lökosit sayısının arttığını bulmak için periferik yaymada lökosit formülü yapılarak lökosit tiplerinin oranlaması yapılır.

Lökopeni: 1mm³ kanda lökosit sayısının 4000’den az olmasına denir.

Lökositoz nedenleri

1-Sistemik enfeksiyonlar: Sepsis, Menengit, Pnömoni vs.

2-Lokal enfeksiyonlar: Apse, Tonsilit, Sinüzit, Otitis media, Ampiyemi vb.

3-Metabolik hastalıklar: Diabetik ketoasidoz, Üremi, Gut, Eklamsi vb.

4-İlaç ve zehirler: Digitaller, Epinefrin, Civa, Co, Pb.

5-Kan yapımı sistemik hastalıkları: Lösemi



Lökopeni nedenleri

1-Bazı akut ve kronik enfeksiyonlar: Tifo, Pratifo, Brucelloz

2-Bazı virüs ve riketsiya hastalıkları: Kızamık, Kızamıkcık, İnfeksiyoz hastalıklar.

3-Bazı protozoal hastalıklar: Leshmaniazis, Sıtma.

4-Hematopoetik hastalıklar: Aplastik anemi, Agranulositoz, Pernisiyoz anemi.
DENEY RAPORU

Adı Soyadı :

No :

İmza :


Deneyde kullandığımız, aşağıda isimleri bulunan malzemelerin kullanım amaçlarını karşılarına yazınız;

1-Turck solüsyonu:

2-Lökosit sulandırma pipeti:

3- Deneyin amacını yazınız.

4- Deneyin yapılışını çok kısa olarak özetleyiniz.

5- Varsa deney esnasında karşılaştığınız güçlükleri ve sizce çözüm yollarını yazınız.

6- Deneyde, anlaşılması güç olan ve anlayamadığınız noktalar varsa bunları yazınız.

4.3. Trombosit Sayımı


Direkt metod:

Esası eritrosit sayımında olduğu gibidir. Kan bir sayım pipetinde sulandırıldıktan sonra bundan alınan bir damla örnek, sayım lamında sayılarak mm3 'deki miktar hesaplanır.



Reaktifler

Sulandırma solüsyonları

(1) Rees-Ecker Solüsyonu:

Brilliant Cresyl Blue 0.l g

Sodyum Sitrat 3,8 g

Formaldehit (9640) 0,2 ml

Distile su ile l00 ml’ ye tamamlanır.

(2) Brecher-Cronkite Solüsyonu: lg Amonyum Oksalat 100ml distile suda eritilir. Eriyik süzülür ve buzdolabında (4oC) saklanır.

Metod:

1-Eritrosit pipetinin 0,5 işaretine kadar sulandırma solüsyonu çekilir. Sulandırma solüsyonunun üst hizası 1 işaretine ve kanın üst hizası 0.5 işaretine gelecek şekilde EDTA’lı kan alınır.

2-Pipetin ucu silinip, fazla kan bulaşığı alındıktan sonra hava kaçırmadan 101 işaretine kadar sulandırma solüsyonundan çekilir.

3-Pipet iyice çalkalanarak, karıştırılır, ilk birkaç damla atılır.

4-Thoma lamı eritrosit sayımında olduğu gibi hazırlanır ve doldurulur.

5-Lam nemli bir petri kutusuna konarak, trombositlerin çökmesi için 15-30 dk oda sıcaklığında bekletilir.

6-Mikroskobun x40 kuru objektifi kullanılarak ortadaki lmm2'lik (lmm x lmm) karedeki trombositler sayılır. Sayım her iki tarafta yapılır. Mikroskobun mikrometresi ile odaklama dikkatle değiştirilerek ve diafragma kapatılıp ışık azaltılarak trombositler kolaylıkla tanınırlar. Trombositler fazlaca refraktil (ışık kıran) cisimcikler halinde görülürler. Rees Ecker solüsyonu kullanıldığı zaman trombositler soluk mavi ufak parçacıklar halindedirler.

Hesaplama yöntemi:

1-Ortadaki karenin hacmi l mm x l mm x 0.l mm= 0.l mm3

İki taraftakinin hacmi 0.1 x 2=0.2mm3 olur.

2-Bu iki karede sayılan trombosit miktarı dilüsyon katsayısı ve 1/0.2=5 ile çarpılır ve 2'ye bölünerek lmm3teki trombosit sayısı bulunur(= 5x 200/2=500)

3- 1 lökosit karesinde sayılarakta bulunur. Bunun için 5 ayrı karede trombosit sayılır ve 5’e bölünür. Çıkan sayı 250 x 200 =50.000 ile çarpılarak trombosit sayısı bulunur.

İndirekt Metod

Formül lökösitler (yayma kan preraratı) için boyanmış lam immersiyonla incelenir ve 1000 eritrosit sayısına karşılık trombosit sayısı tesbit edilir. 1mm3 bulunan eritrosit rakamı ile oran kurulur.

Örneğin:

1000 eritrositle -50 trombosit bulunmuş olsun



4.000.000 eritrosit için X trombosit sayısı

4000000x50 = 200.000 trombosit/mm3


Verilənlər bazası müəlliflik hüququ ilə müdafiə olunur ©azkurs.org 2016
rəhbərliyinə müraciət

    Ana səhifə