I kirish II asosiy qism

Jadval 1. Ushbu tadqiqotda ishlatiladigan plazmidlar
.
 

---

16 
Qisqacha aytganda, pWD002, pWD024 va pWD025 mos ravishda KmYME, 
NP_011545 va NP_011529 ning buzilish kassetasi uchun yaratilgan. pWD004 
EGFP ifodasi uchun tuzilgan; pWD005 va pWD006 KmYME lokalizatsiya tahlilida 
KmYME-EGFP va KmCox-RFP ifodasi uchun tuzilgan. pWD007, pWD008 va 
pWD009 kesilgan KmYME (1-20 aa) -EGFP, KmYME (1-40 aa) -EGFP va 
KmYME (41-360 aa) -EGFP ifodasi uchun mitoxondriyal signal peptidini aniqlash 
uchun tuzilgan. pWD026 KmYME buzilgan va buzilmagan shtammlarning 
mitoxondrial morfologiyasini kuzatish uchun URA3 yorlig'i bilan KmCox-RFP 
ifodasi uchun yaratilgan. pWD010, pWD034 (pWD010 dan GYSLG→GHSMG) va 
pWD035 (pWD010 dan GYSLG→AYALA) E. coli BL21 (DE3) hujayralarida T7 
promouteri ostida KmYME va KmYME mutantlarini ifodalash uchun tuzilgan. 
pWD003, pWD032 (pWD003 dan GYSLG→GHSMG) va pWD033 (pWD003 dan 
GYSLG→AYALA) K. marxianusda ScGAPDH promouteri ostida KmYME va 
KmYME mutantlarini ortiqcha ifodalash uchun ishlatilgan. 
Ushbu tadqiqotda ishlatiladigan barcha xamirturush shtammlari 2-jadvalda 
keltirilgan va Qo'shimcha 1-faylda tasvirlangan: Qo'shimcha S3-rasm. 
Transformatsiya lityum asetat usuli yordamida amalga oshirildi (Abdel-Banat va 
boshq., 2010). Transformantlar tegishli qo'shimchalar bilan SD muhitida skrining 
qilindi va shablon sifatida genomik DNK yordamida PCR tomonidan tasdiqlandi.
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 

---

17 
1.3. 
Alfa/Beta-gidrolaza qatlamli fermentlar: tuzilmalar, funktsiyalar va 
mexanizmlar 
Aspergillus niger qo'ziqorinidan biz a/b-gidrolaza qatlamlarining superoilasi 
a'zosi, ammo substrat o'ziga xosligi noma'lum bo'lgan EstA proteinini kodlovchi 
yangi genni aniqladik. EstA haddan tashqari ifodalangan va uning kristall tuzilishi 
lipaz-asetilxolinesteraza kimera shablonidan foydalangan holda molekulyar 
almashtirish orqali hal qilindi. EstA ning 2,1 Å o'lchamlari strukturasi katta erituvchi 
kirishi mumkin bo'lgan piyola shaklidagi bo'shliqning pastki qismidagi kichik 
cho'ntakda joylashgan kanonik Ser/Glu/Uning katalitik triadasini ochib beradi. 
Qo'lda o'rnatish protseduralari bilan tanlangan potentsial substratlar EstA faoliyati 
uchun tahlil qilindi. Cho'ntak geometriyasiga muvofiq, qisqa asil/propil zanjirli 
substratlarning gidrolizlanishiga ustunlik berildi. Boshqa zamburug'lar genomidan 
yaqin homologlarni aniqlash, ularning ba'zilari keng tarqalgan patogenlar, EstA ni 
superoilada qo'ziqorin esterazlarining yangi sinfining birinchi a'zosi sifatida 
belgilaydi. Shunday qilib, EstA tuzilishi uning patogen gomologlariga qaratilgan 
yangi antifungal vositalarni loyihalashda etakchi shablonni tashkil qiladi.Alfa/beta-
gidrolaz qatlamli fermentlar oilasi tez sur'atlar bilan turli katalitik funktsiyalarga ega 
bo'lgan tizimli bog'liq fermentlarning eng katta guruhiga aylanmoqda. Bu oila 
a'zolariga atsetilxolinesteraza, dielakton gidrolaza, lipaz, tioesteraza, serin 
karboksipeptidaza, prolin iminopeptidaza, prolin oligopeptidaza, haloalkan 
degalogenaza, haloperoksidaza, epoksid gidrolaza, gidroksinitril liza va boshqalar 
kiradi. Fermentlarning barchasi turli xil kimyoviy tarkibga yoki fizik-kimyoviy 
xususiyatlarga ega bo'lgan substratlarda va turli biologik kontekstlarda samarali 
ishlash uchun rivojlangan nukleofil-uning-kislota katalitik triadasiga ega. Masalan, 
atsetilxolin esteraza fermentning faol joyiga substratning diffuziya chegarasiga 
yaqin tezlikda atsetilxolin neyrotransmitterining parchalanishini katalizlaydi. 
Dienelakton gidrolaza aromatik birikmalarni parchalash uchun substrat yordamida 
katalizdan foydalanadi. Lipazalar neytral suvda erimaydigan ester substratlarining 
suv/lipid interfeysida adsorbsiyalangan holda harakat qiladi. Ko'pgina lipazlar 
o'zlarining faol joyini ikkinchi darajali tuzilish elementlari ostida ko'milgan, 

---

18 
qopqoqqa ega bo'lib, substratning faol joyiga kirishiga imkon berish uchun 
konformatsiyasini o'zgartirishi kerak. Tioesterazlar bioluminissensiya, yog 
'kislotalari va poliketidlar biosintezi va metabolizmi kabi ko'plab biokimyoviy 
jarayonlarda ishtirok etadi. Serin karboksipeptidazalar peptid substratlarining 
manfiy zaryadlangan karboksilat uchini taniydilar. Haloalkan degalogenaza 
detoksifikatsiya qiluvchi ferment bo'lib, galogenlangan alifatiklarni tegishli 
spirtlarga aylantiradi, haloperoksidaza esa organik birikmalarning galogenlanishini 
katalizlaydi. Gidroksinitril liaz o'simliklarda mudofaa mexanizmi sifatida 
siyanogidrinlardagi uglerod-uglerod aloqalarini bir vaqtning o'zida vodorod siyanid 
hosil bo'lishi bilan ajratadi. Ushbu maqola tanlangan misollarni muhokama qilish 
orqali ushbu fermentlar oilasi uchun qayd etilgan katalitik faolliklarning umumiy 
ko'rinishini beradi. Katalizning molekulyar asoslari va substrat o'ziga xosligi 
haqidagi bilimlarning hozirgi holati ko'rsatilgan. Faol sayt anatomiyasi, topologiyasi 
va oqsil molekulasidagi konformatsion o'zgarishlar o'rtasidagi munosabatlar ferment 
ta'sir mexanizmi kontekstida muhokama qilinadi.
Saprofit qo'ziqorin Aspergillus 
niger tabiatda keng tarqalgan bo'lib, u organik moddalarda aerob holda o'sadi va 
tuproqda, axlatda va kompostda uchraydi. U shuningdek, chirigan o'simlik 
materialida uchraydi, bu erda o'simlik hujayra devorlaridan polisaxaridlarni 
monomer birikmalarga aylantiradi. Ushbu polisaxaridlar asosan tsellyuloza va 
ksilandan iborat va murakkab matritsa hosil qilganligi sababli, degradatsiya 
polisakkaridazalar spektrini talab qiladi, masalan, pektinazlar, tsellyulazalar va 
hemiselülazalar (de Vries va boshq., 2002). Asosan D-glyukoza yoki D-ksiloza kabi 
monosakkaridlar bo'lgan mahsulotlar qo'ziqorin tomonidan metabollanadi. A. 
Nigerda transkripsiya regulyatori XlnR nafaqat tsellyuloza va ksilan asosiy 
zanjirlarini 
buzuvchi 
hujayradan 
tashqari 
tsellyulolitik 
va 
ksilanolitik 
fermentlarning ifodalanishini nazorat qiladi van Peij va boshqalar. 1998a, van Peij 
va boshqalar. 1998b, shuningdek, polisakkarid magistralining yon guruhlarini 
o'zgartiradigan atsetil ksilan va feruoyl esterazlar kabi yordamchi fermentlar (van 
Peij va boshq., 1998b). Hujayra ichidagi D-ksiloza reduktaza ifodasini nazorat qilish 
orqali XlnR ham D-ksiloza metabolizmida ishtirok etadi (Hasper va boshq., 2000). 

---

19 
A. niger patogen bo'lmagan qo'ziqorin deb hisoblanadi, ammo og'ir kasallik yoki 
immunosupressiv davoga ega bo'lgan bemorlar qo'ziqorin rivojlanishiga yordam 
berishi mumkin. Bundan farqli o'laroq, tegishli A. fumigatus turlari ko'plab 
epidemiologik tadqiqotlar mavzusi bo'lgan muhim va opportunistik inson 
patogenidir. Bu rivojlangan mamlakatlarda invaziv o'pka aspergillozi deb 
nomlanuvchi o'limga olib keladigan havo orqali yuqadigan qo'ziqorin 
infektsiyalarining eng tez-tez uchraydigan sababi bo'lib, immunitet tanqisligi bo'lgan 
bemorlarda o'limga olib keladigan mikozdir (Xan va boshq., 2003). Aspergilloz, 
kriptokokkoz, kandidoz, koksidioidomikoz, gistoplazmoz va blastomikoz kabi 
qo'ziqorinli pnevmoniyalar immuniteti pasaygan xo'jayinlar orasida kasallanish va 
o'limning asosiy sabablaridan biridir. Invaziv mikozlarning ko'payishi va og'irligi 
amfoteritsin B ni almashtirishga qaratilgan yangi antifungal strategiyalarga olib 
keldi, bu endi turli qo'ziqorin infektsiyalari uchun oltin standart emas. Har xil 
mog'orlarga qarshi in vitro va in vivo faolligini ko'rsatadigan vorikonazol va 
kaspofunginni tasdiqlash yaqinda yangi davolash usullarini joriy etdi Gupta va 
Tomas 2003, Kartsonis va boshqalar. 2003 yil. 
A. niger XInR transkripsiya faollashtiruvchisi nazorati ostida bo'lgan protein 
omillarini aniqlashga qaratilgan tadqiqotlarimiz davomida biz noma'lum biologik 
funktsiyaning taxminiy, 538 qoldiq EstA oqsilini kodlaydigan yangi estA genini 
topdik. Ketma-ketlikni moslashtirish EstA ko'plab lipazlar va esterazlar uchun 
umumiy bo'lgan a/b-hidrolaza katlamini baham ko'rishini ko'rsatdi va funktsional 
katalitik triada mavjudligini taklif qildi. EstA biologik funktsiyasini tushunish uchun 
biz EstA ni haddan tashqari ifodaladik, tozaladik va kristallashtirdik. EstA ning 2,1 
Å rezolyutsiyali kristall tuzilishi uning oqsillarning a/b-gidrolaza qatlamlari 
superoilasiga tegishli ekanligini tasdiqlaydi va erituvchiga to‘liq kirish mumkin 
bo‘lgan katta, piyola shaklidagi bo‘shliqning pastki qismida joylashgan 
Ser210/Glu338/His440 katalitik triadasini ochib beradi. EstA substratining o'ziga 
xosligi kremniyda ham, eritmada ham tekshirildi. Bundan tashqari, EstA ning yaqin 
homologlari boshqa qo'ziqorin turlarining tugallanmagan genomlaridan aniqlangan, 

---

20 
ularning ba'zilari keng tarqalgan patogenlardir. Bizning tarkibiy, biokimyoviy va 
hisoblash ma'lumotlarimiz shuni ko'rsatadiki, EstA qisqa asil zanjirli substratlarga 
nisbatan sezilarli o'ziga xos xususiyatga ega va uni oqsillarning a/b-gidrolaza 
qatlamlari superfamiliyasidagi qo'ziqorin esterazlarining yangi oilasining etakchi 
a'zosi sifatida aniqlaydi. 
EstA genining ekspression tahlili va EstA ning biokimyoviy xarakteristikasi 
EstA kodlash hududi genning birinchi 700 zarbasi ichida ikkita intronni o'z ichiga 
oladi (1-rasm). D-ksilozada yetishtirilgan yovvoyi turdagi A. niger shtammi, XlnR 
funksiyasini yo‘qotuvchi shtammi va xlnR ko‘p nusxali shtammi miseliyasidagi 
estA ifodasining Northern blot tahlili estA XlnR transkripsiyasi bilan tartibga 
solinishini tasdiqladi. faollashtiruvchi. 5'-GGCTAA-3' ketma-ketligiga ega bo'lgan 
bitta taxminiy XlnR bog'lanish joyi estA ning promotor hududida teskari yo'nalishda 
topildi, estA translatsiyani boshlash kodonidan 525 bp yuqorida.
(A) Promotordagi 
taxminiy XlnR bog'lanish joyini, tarjimani boshlash joyini (TI), signal peptidini (SP) 
va uning kodlash ketma-ketligini va ikkita intronni, A (59 bp) va B ni ko'rsatadigan 
estA genining sxematik diagrammasi. (48 bp). 
(B) A. niger yovvoyi tipdagi shtammida EstA transkripsiyasining shimoliy blot 
tahlili (Vt; strelka zaif bandga ishora qiladi), XlnR funksiyasini yo‘qotish shtammi 
(XlnR−) va xlnR ko‘p nusxali shtammi ( XlnR+). 
EstA genini A. tubingensis dan kuchli endo-ksilanaz xlnA promouteri nazorati 
ostiga qo'yib, biz A. niger NW128 shtammida EstA ning ajratilgan shaklini 
muvaffaqiyatli oshirib yubordik. Keyin oqsil cheklangan miqdordagi differensial 
ammoniy sulfat cho'kmalari va anion almashinuvi yordamida bir hillikka tozalandi. 
estA geni prognoz qilingan massasi 58,6 kDa bo'lgan 538 qoldiq polipeptid 
zanjirini kodlaydi. Hujayra osti nishon signallarini PSORT II qidiruvi dastlabki 16 
ta qoldiqni o'z ichiga olgan N-terminal signal peptidini aniqladi (von Heijne, 1986). 
Bu tozalangan EstA ning Edmanning avtomatlashtirilgan ketma-ketligi bilan 
tasdiqlandi, u Leu17 ni qayta ishlangan oqsilning N-terminal qoldig'i sifatida aniq 
belgilab, nazariy massasi taxminan 522 qoldiq oqsilini berdi. 56,9 kDa va nazariy pI 
4,73. Shunga qaramay, gel filtrlash va SDS-PAGE tahlillari, ular bitta cho'qqi va 

---

21 
bitta chiziqni ko'rsatdi, ikkalasi ham taxminan taxminan ko'rinadigan massani 
ko'rsatdi. 80 kDa, ya'ni hisoblangan massadan 40% yuqori. Native-PAGE tarqoq 
bo'lsa ham, bitta diapazonga olib keldi va izoelektrik fokuslash pI 4,6-5,0 oralig'ida 
uchdan to'rttagacha intensiv va ikkita zaif diapazonni ko'rsatdi. Ushbu kuzatishlar 
(ma'lumotlar ko'rsatilmagan), ketma-ketlikda Asn-bog'langan glikanlar uchun oltita 
konsensus joylari mavjudligi (quyida qarang), EstA monomer, yuqori glikozillangan 
oqsil bo'lib, peptid zanjirida yoki zanjirida ozgina heterojenlikka ega ekanligini 
ko'rsatdi. posttranslational modifikatsiyadan kelib chiqadigan glikan qismlari. 
EstA a/b-gidrolaza qatlamli oqsillar oilasiga kiradi 
BLAST shablon sifatida EstA ketma-ketligidan foydalangan holda izlaydi, EstA 
ni a/b gidrolaza qatlamlari oilasining yangi a'zosi sifatida aniqladi (Cygler va boshq., 
1993), uning bir nechta a'zolari kristallangan. Biroq, mavjud a/b-gidrolaza oqsili 
tuzilmalaridan birini shablon sifatida foydalanib, molekulyar almashtirish orqali 
EstA tuzilishini hal qilishga urinishlar muvaffaqiyatsizlikka uchradi. Shuning uchun 
EstA ketma-ketligining modulli tashkil etilishi hidrofobik klaster tahlili (HCA) 
(Callebaut va boshq., 1997) yordamida tahlil qilindi va tanlangan eng yuqori 
xitlarning HCA uchastkalari bilan solishtirildi. Eng yuqori modulli homologiyalar 
Torpedo 
californica 
atsetilxolinesteraza 
(AChE) 
(27% 
ketma-ketlik 
identifikatsiyasi) va Geotricum candidum lipazlari 1-2 (32% -33% ketma-ketlik 
identifikatsiyasi), a/a/ subfamiliyasidagi B tipidagi karboksilesteraza/lipazaning 
ikkita fermenti bilan topilgan. b-gidrolaza qatlamlari oilasi, ammo ular HCA 
uchastkalarining alohida hududlari bilan cheklangan. Ushbu kuzatish bizni kristalli 
G. kandidum lipaz molekulasining N-terminalining uchdan ikki qismini kristalli 
sichqonchaning AChE molekulasining C-terminal uchdan bir qismiga ulash orqali 
kimera shablonini loyihalashga undadi (Tajriba tartib-qoidalariga qarang). Ushbu 
kimera shabloni muvaffaqiyatli molekulyar almashtirish jarayoniga olib keldi. 
Yakuniy tuzilma 30-2,1 Å o'lchamlari oralig'ida 15,3% (Rfree, 18,0%) 
kristallografik R omil qiymatiga va yaxshi stereokimyoga ega (1-jadval). Yakuniy 
elektron zichlik xaritalarini tekshirish bizga siqish artefaktlari tufayli dastlabki estA 
ketma-ketligida bashorat qilinmagan, ammo keyin cDNKni qayta tartiblash bilan 

---

22 
tasdiqlangan intron A ni aniqlashga imkon berdi (1-rasm) va chiqarilgan EstAdagi 
bir nechta noaniqliklarni tuzatish. ketma-ketlik.
Faol sayt cho'ntagi ikkita pastki 
qismdan iborat bo'lib ko'rinadi: katalitik mexanizmni o'z ichiga olgan va Phe240, 
Trp301, Phe342 va Phe400 qoldiqlaridan tashkil topgan aromatik klaster bilan 
qoplangan asil cho'ntagi va ikkinchi bo'linma asosan qoldiqlardan iborat. qutbli, 
EstA tabiiy substrati bo'lishi mumkin 2-rasm, 3-rasm. EstA faol joyining erituvchiga 
to'liq kirishi va ushbu faol joy cho'ntagining chetida hidrofobik yamoqning yo'qligi, 
asosan, EstA ning esteraza emas, balki haqiqiy esteraza vazifasini bajarishini 
ko'rsatadi. lipaza. 
EstA molekulyar yuzasida elektrostatik potentsiallarni tahlil qilish faol maydon 
bo'shlig'i ochilgan yuz uchun sezilarli ijobiy potentsialni va qarama-qarshi yuz 
uchun salbiy potentsialni aniqladi (ma'lumotlar ko'rsatilmagan). Ushbu umumiy 
anizotrop taqsimot EstA ga faol joy bo'shlig'ining markaziy o'qi bo'ylab 
yo'naltirilgan vektor bilan sichqoncha AChE ning yarmiga teng dipol momentini 
beradi. Bundan tashqari, salbiy sirt potentsiali ko'pincha faol maydon bo'shlig'ining 
tashqi kirish qismini o'rab turgan halqa shaklini hosil qiladi. Agar EstA beshta glikan 
zanjirining ba'zilari sialillangan bo'lsa, EstA dipol momenti yanada sezilarli bo'ladi. 
Ushbu kuzatishlar nafaqat elektrostatik gradient AChE (Ripoll va boshq., 1993) 
uchun topilganidek, musbat zaryadlangan substratlar yoki boshqa kationlarni faol 
maydonga yo'naltirishi mumkinligini, balki EstA elektrotaktinlarning atipik sinfiga 
tegishli bo'lishi mumkinligini ko'rsatadi (Botti va boshq. ., 1998), a/b-gidrolaza 
qatlamlari oilasida o'ziga xos sirt zaryadining taqsimlanishi va yopishqoqlik 
xususiyatlari bilan ajralib turadi. Ikkinchisi EstA glikanlarining yuqorida taxmin 
qilingan tan olinishi roliga mos keladi. 
EstA ning biologik funktsiyasini tushunish va uni esteraza yoki lipaza sifatida 
aniqlash uchun EstA tanlangan substratlarda tahlil qilindi (4-rasmdagi kimyoviy 
tuzilmalarga qarang; 2-jadval). Esterazalar eruvchanlik chegarasidan ancha past 
konsentratsiyalarda qisqa zanjirli vinil esterlar va triatsilgliserinlar eritmalariga 
nisbatan maksimal faollikni namoyon qilsa, lipazlar emulsiyalangan substratlarga 
nisbatan maksimal faollikni namoyon etadi (Chahinian va boshq., 2002). EstA 

---

23 
trioktanoin emulsiyalarida yoki zaytun moyida lipaz faolligini, sinnamoil, feruolil 
yoki pNP substratlarida esteraza faolligini aniqlamaydi. Aksincha, u vinil esterlar va 
triatsilgliserinlarni samarali gidrolizlaydi, kinetik parametrlari esteraza harakati va 
substratning o'ziga xosligi AChE ga o'xshash. Vinil esterlarni glitserinli 
substratlarga aniq afzal ko'radigan cho'chqa jigari esterazasidan farqli o'laroq, EstA 
spirt qismining tabiatini afzal ko'rmaydi; Buning o'rniga u atsetat > propionat >> 
butirat va triatsetin >> tripropionin > tributirin buyurtmalariga ega qisqa zanjirli atsil 
qismlarini afzal ko'radi. Optimal faollik pH 5,0-5,5 oralig'ida topilgan, bu qo'ziqorin 
metabolizmi uchun pH talabiga mos keladi. Ushbu ma'lumotlar EstA katalitik 
uchastkasi ikki uglerod atomidan uzunroq vinil/atsil zanjiri bo'lgan substratlarni 
joylashtira olmasligini ko'rsatadi va Phe342 va Phe400 yon zanjirlari katalitik 
His440ga hidrofobik muhitni beradi, bu ko'pincha faolligi bo'lgan boshqa 
gidrolazalarda kuzatiladi.