I kirish II asosiy qism

1.2. 
Yangi alfa/beta gidrolaza domen oqsilining K. marxianusning 
lignoselülozik biomassadan olingan ingibitorlarga chidamliligiga 
ta'siri. 
Mikroorganizmning ko'p inhibitorlarga chidamliligi bioyoqilg'i va boshqa kimyoviy 
moddalar uchun istiqbolli qayta tiklanadigan va barqaror manba bo'lgan 
lignoselülozik biomassaning biokonversiyasida muhim ahamiyatga ega. Ushbu 
tadqiqotda KmYME deb nomlangan va mitoxondriyada joylashgan noma'lum a/b 
gidrolazaning buzilishi xamirturushning lignoselülozadan olingan inhibitorlarga, 
xususan, sirka kislotasi, furfural va 5-HMFga nisbatan sezgir bo'lishiga olib keldi. 
KmYME buzilgan shtamm ko'proq mitoxondriyal membrana potentsialini yo'qotdi, 
plazma membranasining o'tkazuvchanligini, qattiq redoks nisbati nomutanosibligini 
va ROS to'planishini ko'rsatdi, xuddi shu inhibitorlar ishtirokida buzilmagan shtamm 
bilan solishtirganda. KmYME buzilgan shtammdagi ATP, NAD va NADP ning 
hujayra ichidagi kontsentratsiyasi kamaydi. Biroq, KmYME ning buzilishi 
transkripsiya darajasida gen ifodasining sezilarli o'zgarishiga olib kelmadi. KmYME 
inhibitorlarga qarshilik ko'rsatish uchun zarur bo'lgan esteraza/tioesteraza faolligiga 
ega edi. Bundan tashqari, etanol, harorat va osmotik bosim kabi boshqa stresslarga 
qarshilik ko'rsatish uchun KmYME ham talab qilingan. S. cerevisiae da ikki mumkin 
boʻlgan gomologik genlarning buzilishi ham uning ingibitorlarga chidamliligini 
pasaytirdi.
Grafik abstrakt. K. marxianusdagi KmYME ingibitorlariga mumkin bo'lgan 
bardoshlik mexanizmlari. 

---

13 
Lignoselülozik biomassa arzonligi, keng miqyosda mavjudligi va oziq-ovqat 
ishlab chiqarish bilan raqobatlashmasligi tufayli qayta tiklanadigan bioyoqilg'i va 
boshqa kimyoviy moddalar uchun istiqbolli manba hisoblanadi (Kamm va Kamm, 
2004; Yinbo va boshq., 2006; Somerville va boshqalar. , 2010). Biroq, 
lignoselülozik biomassani oldindan tozalash jarayonida ingibitorlar shakar va lignin 
degradatsiyasining yon mahsuloti, shu jumladan zaif kislotalar, furan hosilalari va 
fenolik birikmalar sifatida hosil bo'ladi. Ushbu birikmalar mikrob hujayralari 
metabolizmi va fermentatsiyasini inhibe qiluvchi turli xil toksik mexanizmlar va 
sinergik ta'sirga ega (Palmqvist va Hahn-Hägerdal, 2000; Almeida va boshq., 2007). 
Demak, ushbu inhibitorlarga chidamlilik mexanizmini aniqlash sanoat 
fermentatsiyasi uchun mustahkam shtammni qurishda muhim ahamiyatga ega. 
Kluyveromyces marxianus "umuman xavfsiz deb hisoblanadigan" (GRAS) 
mikroorganizm bo'lib, u termobardoshliligi, yuqori o'sish tezligi va keng substrat 
spektri tufayli lignoselülozik biomassaning bioetanol fermentatsiyasida tobora 
ko'proq e'tiborni tortdi (Zhang va boshq., 2015). K. marxianus shtammlari 40°C 
haroratda 0,86–0,99 soat–1 oʻsish tezligi bilan oʻsishi mumkin, baʼzi shtammlar esa 
52°C gacha boʻlgan haroratda ham oʻsadi (Banat va Marchant, 1995). Ko'tarilgan 
harorat lignotsellyulozani shakarlashda ishlatiladigan tsellyulolitik fermentlar uchun 
mos keladi (optimal harorat 45-50 ° C) va bir vaqtning o'zida shakarlanish va 
fermentatsiya (SSF), shuningdek, bir vaqtning o'zida shakarlash va kofermentatsiya 
(SSCF) uchun afzalliklarni beradi (Chjan va boshq. , 2016; Kong va boshqalar, 
2019). Bundan tashqari, yuqori haroratda sanoat fermentatsiyasi sovutish narxini va 
ifloslanish xavfini kamaytiradi (Banat va Marchant, 1995). Ksiloza glyukozadan 
tashqari lignoselülozik biomassaning asosiy gidroliz mahsulotlaridan biridir va K. 
marxianus tabiiy ravishda ksilozadan foydalanishi mumkin (Wilkins va boshq., 
2008). Biroq, K. marxianusning bir nechta inhibitorlarga tolerantligi juda kuchli 
emas va K. marxianusning bir nechta inhibitorlarga tolerantligi haqidagi bilim 
oldingi tadqiqotlarda kam edi (Oliva va boshq., 2003; Oliva va boshq., 2004). 

---

14 
Oldingi tadqiqotimizda, K. marxianusning xarakterlanmagan a/b-gidrolaz 
domenini (ABHD) o'z ichiga olgan gen (GenBank BAP69980, joylashuv yorlig'i 
KMAR_10772) ifodasi lignoselülozik bilan oldindan ishlov berishdan olingan 
inhibitorlar ishtirokida sezilarli darajada yuqori tartibga solingan. biomassa (Vang 
va boshq., 2018). Bu erda biz uning ingibitorlarga tolerantlikka ta'siriga, oqsil 
xususiyatiga va uning inhibitorlariga bardoshlik mexanizmiga e'tibor qaratdik. Biz 
ushbu genning buzilishi K. marxianusdagi inhibitorlarga nisbatan tolerantlikni 
kamaytirishini aniqladik. Ushbu noma'lum protein mitoxondriya matritsasida 
joylashganligi va inhibitorlarga qarshilik ko'rsatish uchun zarur bo'lgan in vitro 
esteraza/tioesteraza faolligiga ega ekanligi aniqlandi. Biz ushbu genning buzilishi 
ingibitorlar ishtirokida ATP va NAD(P)H sinteziga xalaqit beradigan hujayra 
ichidagi CoASH hovuzini buzish orqali inhibitorlarga nisbatan bardoshlikni 
pasaytiradi, degan xulosaga keldik. Bundan tashqari, KmYME osmik bosim (shakar 
va tuz), etanol va haroratni o'z ichiga olgan boshqa stresslarga qarshilikning keng 
spektrini ko'rsatdi. Saccharomyces cerevisiae tarkibidagi gomologik oqsil ham bir 
nechta inhibitorlarga qarshilik ko'rsatdi. Ushbu tadqiqot bir nechta inhibitorlarning 
qarshilik mexanizmini yaxshiroq tushunish uchun foydali ma'lumotlarni taqdim 
etishi mumkin, bu esa tsellyuloza biomassasini substrat sifatida ishlatishi mumkin 
bo'lgan sanoat fermentatsiyasi uchun mustahkam shtammni yaratishda muhim 
ahamiyatga ega.
Xamirturush ekstrakti/pepton dekstrozi (YPD) 10 g/l xamirturush ekstrakti, 
20 g/l pepton, 20 g/l glyukoza o'z ichiga olgan achitqilarni etishtirish uchun 
ishlatilgan. Aminokislotalarsiz 6,7 g/L achitqi azot asosini o'z ichiga olgan sintetik 
tomchi (SD) muhiti, tegishli qo'shimchalar bilan to'ldirilgan 20 g / l glyukoza 
xamirturush transformantlarini tekshirish uchun ishlatilgan. 100 mkg/ml 
ampitsillinli Luria-Bertani (LB) muhiti gen klonlash uchun Escherichia coli Top10 
va oqsilni ifodalash uchun BL21 (DE3) ni etishtirish uchun ishlatilgan. K. marxianus 
NBRC1777 NITE Biologik Resurs Markazidan (Tokio, Yaponiya) olingan. K. 
marxianus YHJ010 NBRC1777 ning TRP1, LEU2, URA3 auksotrofik shtammidir 

---

15 
(Hong va boshq., 2007). S. cerevisiae W303 1A ADE2, TRP1, LEU2, URA3 va 
HIS3 oksotrofik shtammidir (ATCC 208352). 
Ushbu tadqiqotda foydalanilgan barcha plazmidlar 1-jadvalda keltirilgan. 
Plazmid konstruktsiyasi 1-qo'shimcha faylda batafsil tavsiflangan. Primer juftlari 
qo'shimcha fayl 1da keltirilgan: qo'shimcha jadval S1.