Mavzu: kirish. Mikrobiologiya fani va uning vazifasi

SAVOLLAR:

1. Mikrobiologiya qachon fan sifatida yuzaga keldi?
2. Mikrobiologiya fanining rivojlanishida fiziologik davriga qachon asos solindi?
3. Mikroorganizmlarning bo’yash va qattik ozuqali kulturalarda o’stirish usuliga kim asos soldi?
4. O’zbekistonda mikrobiologiya fanini rivojlanishiga xizmat qilgan olimlar kimlar?


3 - MA’RUZA
MAVZU: MIKROBIOLOGIK TADQIQOTLARNING ASOSIY USULLARI

REJA:

1. Mikrobiologik preparatlar tayyorlash usullari

2. Mikroblarni bo’yash. Gram usulida bo’yash.
2. Mikroskop xillari va ishlatish prinsiplari.
3. Mikroorganizmlarni o’ldirish usullari.
4. Sof muhit ajratish.


TAYANCH IBORALAR: Mikroskop, preparat, bo’yok, bo’yash, Gram, mazok, fiksasiya, lyuminsensent, suyuq va qattiq oziqali muhit, sof muhit, sintetik, tabiiy.

Mikroorganizmlarni o’rganish uchun xar xil tuzilgan mikroskoplar ishlatiladi. Bizga ma’lumki, birinchi marta oddiy mikroskopni aka-uka Yansenlar 1590 yili ixtiro qilgandan keyin 1610 yili Galiley yana takomillashtirdi. So’ngra golland olimi Anton Levenguk 250-300 marotaba kattalashtirib ko’rsatadigan mikroskop yaratib birinchi marta mikroblarni ko’rdi.

Biz qullaydigan yorug’lik, ya’ni biologik mikroskop deb yuritiladi. Okulyarning ko’rsatish darajasi uning halqasidagi 7x 8 x va 15 x belgilar bilan ifodalanadi. Tubusning pastki uchida revolver vositasida obyektiv o’rnatiladi. Obyektivlar ustiga 8 x, va 120 x ishoralari yozilgan bo’lib, ular obyektivlarni kuchini va bir necha barobar katta qilib ko’rsatishini ifodalaydi.
Mikroorganizmlarni tekshirganda asosan 90 x yoki 120 x li obyektivlarni ishlatish vaqtida tayyorlangan va kuzatilgan obyektga kedr yog’i kastorka moyi tomiziladi.
Bundan tashqari Flyuoressentli mikroskop ishlatiladi. Bu mamlakatda birinchi ishlab chiqilgan bo’lib, M.N.Meysel tomonidan ixtiro qilingan. Bu metodda mikrob tanasi flyuoroxrom bilan bo’yalib uzun va qisqa tulqin orqali ko’riladi. Bunda asosan yomon ko’rinadigan mikroorganizmlar bo’yalib ultrafiolet va yorug’lik mikroskoplari bilan ko’rilib ishlatiladi. Bu mikroskop ancha qulay bo’lib, maxsus mikroskop talab etilmaydi. Bu metod orqali faqat tirik organizmlar ko’riladi va uning tirik organizmga ziyoni yuq.
ELEKTRON MIKROSKOP – fan va texnikaning o’sishi tufayli organizmlarni faqat yorug’lik mikroskoplaridan tashqari katta kursatish bilan xujayrani submikroskopik tuzilishini ham o’rganila bordilar. Bu elektron mikroskop orqali o’rganildi.
XX asrning 30-40 yillarida yaratilgan elektron mikroskoplar xo’jayra organoidlarining strukturasi bilan funksiyasi orasidagi bog’lanishni aniqlashga mikroorganizmlardagi bioximiyaviy prosesslarni o’rganishga imkon berdi. Elektron mikroskopda elektrondan chiqadigan nurning to’lqin uzunligi yorug’lik nurining to’lqin uzunligiga nisbatan ancha qiskacha. Unda shisha linzalar o’rniga «elektron linzalar» – «elektromagnit maydonlar» paydo bo’ladi, bular buyumlar molekulalarini yutadi, barcha optik sistema vakuumga joylashtiriladi. Shuning uchun ko’riladigan obyektlar quruk bo’lishi kerak. Aks holda obyektdagi suv vakuumda qaynab ketadi va buyum siqiladi. Elektronlar orqali tekshiriladigan obyektga tushganda, termik va radiasion o’zgarishlar sodir bo’ladi bu esa buyumning strukturasini buzib yuborishi mumkin. Tekshiriladigan buyumlar, odatda o’nlik-o’nming, 30 ming marotaba kattalashtirib o’rganiladi.
Elektron mikroskoplarda ko’riladigan buyumlar nihoyatda yupqa bo’lishi kerak. Shvesiyalik olim Shestrand elektron mikroskop uchun yupqa kesiklar tayyorlaydigan mikrotom yaratdi. Bu mikrotom yordamida tayyorlanadigan kesiklarning qalinligi 100-150 A ga teng bo’ladi. Ko’riladigan buyumning suvi quritilib so’ngra fiksasiya qilinadi va qotirish uchun metakril smolasi ta’sir etiladi. Shundan keyin mikrotomda 100-150 A kalinlikda kesiklar tayyorlanib, elektron mikroskopda ko’riladi. Biz asosan mikrobni o’rganganimizda turli biologik xususiyatlarini aniqlashni kuzda tutiladi.
Mikroorganizmlar ko’pincha o’ldirib tekshiriladi, ba’zan uni tirik holda ham tekshirish mumkin. Tekshirilganda mikroorganizmlarning shakli, tuzilishi, bo’yalish xususiyati, hamda fiziologik va boshqa xususiyatlari o’rganilib natijada tekshiriladigan mikroorganizm qaysi tur, gruppa va turkumga tegishli ekanligini aniqlash mumkin.
Dasavval uning morfologik tuzilishi o’rganiladi. Buning uchun zich muhitli kattiq mikrob kulturasidan bakterial sim ilmok yordamida yoki suyuq kulturadan Paster pipetkasi bilan bir oz olinib, buyum oynacha surtilib quritiladi va alanga ustidan 2-3 marta o’tkazib fiksasiya qilinadi. Bunday fiksasiyalash fizikaviy usul deyiladi.
Mikrobiologiyada mikroblarni bo’yashni oddiy va murakkab usullari mavjud. Oddiy bo’yash usullarida bir xil buyoqlardan, ya’ni suyultirilgan fuksin (1%10) buyogi, metil sinkasi va boshqalar qullaniladi. Murakkab bo’yash usulida 2-3 bo’yok ishlatiladi. Bu usul mikroblarning turli buyoq va reaktivlarga turlicha munosabatda bo’lishiga asoslangan.
Bu bo’yashning ahamiyati shundan iboratki, fiksasiya qilingan preparatlarning gension-violet bo’yog’i yod eritmasi bilan bo’yalgan va mustaxkam protoplazm bilan birikkan bo’lib, spirtda erimaydi. Ba’zi bakteriyalarning xujayrasi bo’yalganda u spirtda erib ketadi. Shuning uchun xam murakkab bo’yash usulida ikki-uch bo’yoq ishlatilib, mikroblarning turli bo’yoq va reaktivlarga turlicha munosabatda bo’lishiga asoslangan.
Gram usulida bo’yalganda,bo’yoqqa bo’lgan munosabatga qarab ikki xil, ya’ni Gram-musbat va Gram-manfiy bo’ladi.
A). Gram usulida bo’yalganda ba’zi mikroblar binafsha rangiga yakinroq bo’lib bo’yaladi. Bunday ranga bo’yaluvchi mikroorganizmlarni Gram musbat bo’yaluvchilar deyiladi.
B). Aksincha, ba’zi mikroblar Gram usulida fuksin rangiga, ya’ni och qizil rangga bo’yaladi, bu xilda och-qizilga bo’yaluvchi mikroorganizmlar Gram-manfiy bo’yaluvchilar deb ataladi.
Gram musbat va gram-manfiy bo’yalishning sababi mikrob tanasida ribonuklein kislotasining magniylik tuzi bor-yo’qligiga bog’liqdir. Mikroorganizmlarning tanasida ribonuklein kislotasining magniylik tuzi bo’lsa, unda mikrob gension-violet bo’yog’i bilan bo’yalganda ham u bo’yoqni o’z tanasida mahkam saqlab qoladi, preparatga spirt bilan ta’sir etilsa ham gension violet tusda bo’yalgan bo’ladi. Bu rangdagi mikroblarni Gram musbat dedik, gram manfiy bo’yaluvchi mikroorganizmlarda esa ribonuklein kislotasining magniyli tuzi bo’lmaydi. Shuning uchun unday mikroorganizmlar gension-violet bo’yog’ini tanasida mahkam saqlab qolaolmaydi, preparatga spirt bilan ta’sir etilganda gension-violet tusda bo’yog’i u xildagi mikroorganizmlarning tanasidan yuvilib ketadi, och-qizil rangga bo’yalib qoladi. Kuo’chilik sharsimon bakteriyalar achitqi nursimon zamburug’lar gram-musbat bo’yaladi. Ayrim tayoqchasimon bakteriyalar (kolibakteroid, karatid, brusellyoz va boshqa kasalliklarni quzg’atuvchilar) vibrionlar, spirillalar, risketsiyalar gram-manfiy bo’yaladi.
Sporalarni bo’yash. Buning uchun maxsus murakkab bo’yash usullari qullaniladi. Sporalarni bo’yash uchun uning qobigi yumshatilishi kerak, buning uchun yuqori temperaturadan, kislota, ishqor va boshqa moddalardan foydalaniladi. Bo’yalgan sporalar kislota va ishqor ta’sirida o’z rangini yo’qotmaydi. Sporalarni bo’yashni bir qancha usullari bor, ulardan Zlatogorev usuli eng ko’p qo’llaniladi. Fiksasiyalangan preparat ustiga filtr qogizi yopib, ustiga fuksin bo’yog’i qo’yiladi va alanga ustiga 5-10 minut to bug’ chiqkuncha qizdirilib bo’yaladi. Qog’oz olib tashlanib preparat 10 sekund 2 % li N ₂ SO ₄ ning eritmasi bilan rangsizlantiriladi va so’ngra suv bilan yuviladi. Preparat bir minut davomida metilen sinkasi bilan yaxshilab bo’yalib quritiladi va quriladi.
Bakteriyalar kapsulasini aniqlash.
Mikroorganizm oddiy usulda bo’yalganda kapsula ko’rinmaydi, chunki u bu bo’yoqda bo’yalmaydi. Kapsulani aniqlash uchun zararlangan parenximatoz organlardan taxma preparat tayyorlanadi, yoki Paster pipetkasi bilan yurak qoni olinib surtma preparat tayyorlanadi, keyin quritiladi, spirt yoki spirt-efirda 15-30 minut fiksasiyalanadi.
Kislotaga chidamli bakteriyalarni bo’yash.
Ayrim mikroorganizmlar mineral kislotalar ta’siriga chidamli bo’lib, odatdagi bo’yoqlar bilan yaxshi buyalmaydi. Shuning uchun ular konsentrlangan bo’yok eritmalari bilan qizdirilib bo’yaladi. O’ziga qabul qilgan bo’yoqni ular spirt va kislotalarning kuchli eritmasi ta’sirida ham ketkazmaydi. Ularning bunday xususiyati differensial diagnoz quyishda ko’p qullaniladi. Sil tayoqchasi, qora tuberkulyoz, enterit tayoqchasi va sutda, sariyoqda, tuproqda, gungda, qonli hayvonlar organizmida uchraydigan bakteriyalar kislotaga chidamli bo’ladi. Achitqi va nursimon zamburug’larni mikroskopik tekshirish uchun surtma preparat tayyorlanib, uni quritib fiksasiyalab oddiy usul bilan bo’yab mikroskopda ko’riladi.
Spiroxetalarni tekshirish uchun asosan korong’ilashtirilgan, lekin ko’rish mumkin bo’lgan maydonda yoki negativ preparatlarda ko’riladi. Spiroxetalar asosiy bo’yoqlar (metilin sinkasi) bilan yaxshi bo’yaladi.
Romanovskiy-Gimza usuli bilan 1-3 sutka bo’yalganda spiroxetalar yaxshi bo’yalib, ipsimon ko’rinadi. Tovuqlar tekshirilganda bir tomchi qon bir ikki tomchi tush bilan aralashtirib havoda ko’ritiladi va tekshiriladi, spiroxetalar qora preparatda oq to’lqinsimon ip shaklida ko’rinadi. Sodda jonivorlarni tekshirishda turli usullar qullaniladi: agar ular tirik holda tekshirilsa osilgan tomchi, boshqa hollarda esa murakkab bo’yash usullari qo’llaniladi. Masalan, Romanovskiy-Gimza usuli. Viruslarni mikroskopda tekshirish usullari.
Mikroorganizmlarni tekshrish vaqtida ishlatiladigan ozik-mahsulotlarni tekshirish metodlari.
Mikroorganizmlarni tekshirish va o’rganish va ularni bir-biridan ajratish uchun turli tuman oziqali kulturalar tayyorlanadi. Bular quyidagicha:
Peptonli go’sht sho’rvasi (PGSh).
Bu sho’rvani tayyorlash uchun avvalo 500 g go’sht suyak, chandir va yog’dan tozalab maydalanadi. Maydalangan go’shtga 1 l suv qushilib 15 s temperaturada 24 soat tinch qoldiriladi. Bu vaqt o’tgandan so’ng go’sht aralashtirilgan suv doka orqali kolbaga filtrlanadi . Bu filtrat 30 minut qaynatiladi va issiqligicha filtrlanadi. 1 l go’sht sho’rvasi 10 g pepton va 5 g osh tuzi qo’shiladi. Qo’shilgan pepton eriguncha sho’rva isitiladi. Peptonli sho’rvani neytral holga keltirish uchun unga kristallik soda qo’shiladi. U loyqalanadi va tindirish uchun avtoklavlarga joylanib 120 gradusli issiqlikda 15-30 minut qizdiriladi. Bu sho’rva sovugandan so’ng ovqat muhiti sifatida ishlatiladi. Bu bakteriyalarning turini aniqlash uchun uncha qulay emas. Shuning uchun qattiq ozuqali muhit ishlatiladi. Qattiq oziq muhit sifatida jelatin va agar-agar ishlatiladi.
Go’sht-peptonli jelatin (GPJ).
Bu oziq muhitni tayyorlash uchun 1 l go’sht-pepton sho’rvaga 100-120 g maydalangan jelatin qushiladi. Sho’rvaga qo’shilgan jelatinni eritish uchun kolba Kox qaynatigichida yoki avtoklavda qizdiriladi. U avtoklavdan olinib filtrlanadi. Filtrat probirka yoki kolbalarga taqsimlanadi. Probirka va kolbalarni og’zi paxta bilan bekitiladi. U yana Kox qaynatgichida qaynatiladi bir sutkadan so’ng yana sterillanadi. GPJ asosan sovuq sharoitda ishlatiladi (24 gradus S u suyuladi).
Go’sht-peptonli agar-agar aralash ozuqali muhit (GPA).
Buning uchun tayyor agar poroshogidan 4 g tortib olinib 100 ml suvga solib qaynatib so’ngra sterillangan idishlarga solinadi va qotiriladi. Bundan tashqari tuganak bakteriyalar va achitqilarni o’stirish uchun achitqi suvi tayyorlanadi. Buning uchun svejiy yoki presslangan achitqidan 70-100 g tortib olinib 1 l disstillangan suvga solib eritiladi va 30 minut qizdiriladi. So’ngra katta silindrga solinib sovutiladi va filtrlanadi. Uni sterillash maqsadida yana Kox isitgichida 20 minutdan 2-3 kun qaynatiladi, so’ngra undan foydalaniladi.
Bundan tashqari yarim sintetik va sintetik ozuqa qo’llaniladi. Ko’pchilik Pseudoneoceas, Bacterium Mycobacterium va boshqalar asosan go’sht-peptonli oziqada o’stiriladi, ammo bundan tashqari sintetik ozuqali muhitda ham o’stirish mumkin.
SREDA № 1 (g/l)
Glyukoza - 20,0
MH₄Ce - 1.0
K₂NRO₄ - 0.5
Mg SO₄H₂O - 0/5
CaCo₃ - 20-30
P H sredы - 7.1-7.2
Avtotrof bakteriyalar uchun qo’yidagi Van-Nilb ozuqasi tayyorlanadi (serob bakteriyalar uchun) (s/n)
NaHSO₃ - 1,0
NH₄CI - 1,0
Na₂SH₂ – 1.0
Mg CI_6.N₂O – 0.2
K₂HPO₄ - 0.5.
Nitrifikasiya bakteriyalari uchun Vinogradskiy ozuqasi quyidagicha tayyorlanadi.
(g/l) CaCo₃ - 10.0
(NH₄)₂SO₄ – 2.0
K₂HPO₄ – 1.0
MgSO₄H₂O – 0.5
Na Ce - 2.0
FeSO₄4H₂O - 0.4
Mikroorganizmlar kulturasini tayyorlash uchun asosan uni shu yerda o’stirib ko’paytirishdir. Toza kultura bu mikroblarning faqat bitta turidan iborat.
Aralash kulturasi – bu birinchi tabiatdan, ya’ni tuproqdan, havo va suvdan olingan aralash kulturasidir.
Elektiv kultura – bu biror to’pdan olib alohida ajratib biron suyuqlik yoki qattiq ozuqada o’stirilgandir. Bular biror bankada yoki probirkada saqlanadi. Buni saqlash uchun past temperaturada yoki ozuqasini almashtirib turiladi. Agar u uzoq muddatga saqlanmoqchi bo’linsa kultura qo’ritiladi havosiz joyda ularning biron ampulada og’zi kovsharlab quyiladi, yoki suyuq azotni ichida saqlanadi. Shunday qilib mikroblarning turli hil ozuqali kulturada o’stirib sof kulturasini ajratib mikroskopda o’rganishga mikrokultural metod deb yuritiladi.