Plumbaginaceae from saudi arabia using its sequences of nuclear ribosomal dna

Materials and Methods 

Plant Materials 

Plant materials for sequencing of ITS sequences of nuclear riboso-

mal  DNA  were  collected  during  field  trip  or  from  the  herbarium 

specimens.  Voucher  specimens  for  the  plant  material  used  in  the 

experiment  are  listed  in  [Table-1].  Leaves  were  dried  in  silica  gel 

prior to DNA extraction. 

Table 1- Voucher information and GenBank accession number for 

the taxon sequenced in the present study 

Total Genomic DNA Extraction 

Total genomic DNA was extracted using the DNeasy Plant Mini kit 

(QIAGEN Inc., Crawley, West Sussex, UK). In brief, 20mg silica gel 

dried leaf tissue was taken in 1.5 ml eppendorf cup, and 5-6 tung-

sten  carbide  bead  placed  in  eppendorf  cup.  The  eppendorf  cup 

(with  leaf  and  tungsten  carbide  bead)  placed  in  tissue  lyser  and 

grinded  the  leaves  sample  for  2-3  minutes.  Eppendorf  cup  were 

taken  out  from  tissue  lyser  after  grinding,  and  4  ul  RNase  stock 

solution (100 mg/ml) and 400ul Buffer AP1 was added and vortex. 

Buffer  AP1  is  the  main  extraction  buffer  which  isolates  DNA  from 

the cells. The purpose of adding RNase (an enzyme) was to break 

the RNA into small pieces which remain in the cell, so that easy to 

pass from filter. After adding 4 ul RNase and 400 ul Buffer AP1 in to 

the eppendorf cup containing grinded leaf tissue, the eppendorf cup 

were place in the water bath or dry bath to incubate the mixture of 4 

ul RNase, 400 ul Buffer AP1 and grinded leaf tissue for 10 minutes 

at 65ºC. It was mixed 2 or 3 times during the incubation period by 

inverting the tubes gently. After 10 minutes of incubation the eppen-

dorf cup was taken out from water bath or dry bath, and 130 ul Buff-

er AP2 was added to the eppendorf cup containing Lysate and then 

mixed it properly by inverting the tubes and then incubated the ep-

pendorf tube (containing mixture of 4 ul RNase, 400 ul Buffer AP1, 

grinded leaf tissue and Buffer AP2) for 5 minutes on ice. After cold 

incubation for 5 minute on ice, the eppendorf cup (containing mix-

ture of 4 ul RNase, 400 ul Buffer AP1, grinded leaf tissue and Buffer 

AP2)  were  taken  out  and  kept  on  the  room  temperature  for  10 

minutes. Now the eppendorf cup (containing cold incubated mixture 

of  4  ul  RNase,  400  ul  Buffer  AP1,  grinded  leaf  tissue  and  Buffer 

AP2) placed into centrifuge machine and centrifuge the eppendorf 

tube (containing cold incubated mixture of 4 ul RNase, 400 ul Buffer 

AP1,  grinded  leaf  tissue  and  Buffer  AP2)  at  14000  rpm  for  5 

minutes.  After  centrifugation,  the  clear  or  colorless  Lysate 

(supernatant, which contains DNA) transferred to QIAshredder mini 

spin column lilac- pink in color which is sitting or placed in a 2 ml 

collection tube), and centrifuge it for 2 minutes at 14000 rpm. The 

clear lysate (obtained into 2 ml collection tube after centrifuge trans-

ferred to the collection tube, and 1.5 volume Buffer AP3/E added to 

the clear lysate and mix it by pippeting. AP3/E is the binding buffer. 

Now  650ul  of  the  mixture  (mixture  of  clear  lysate  containing  DNA 

and buffer AP3/E) was transferred into DNeasy mini spin colorless 

column (which are colorless and placed or sitting into 2 ml collection 

tube, supplied along with kit) and Centrifuge it for 1 minute at 8000 

rpm. The flow through comes out into the collection tube after cen-

trifuge was of no use therefore it was discarded. The process was 

repeated with the remaining lysate to get DNA on the filter. The filter 

was kept on room temperature before washing. For washing 500 ml 

Buffer AW was added to DNeasy mini spin column containing DNA 

and centrifuge 2 minutes at 14000 rpm. Flow through was discard-

ed and the process of washing repeated again. After completion of 

washing, the DNeasy mini spin column containing DNA was kept on 

room  temperature  for  5  minutes,  and  then  for  elution,  100ul  steri-

lized  double  distilled  water  (pyrogen  free)  was  added  to  DNeasy 

mini  spin  column  containing  DNA  and  centrifuge  for  2  minute  at 

14000  rpm.  After  elution,  the  DNA  transferred  to  fresh  1.5  ml  ep-

pendorf tube and stored at -20 for further use of PCR.