Pzr uchun ishchi aralashma (master mix ) tayyorlash va termotsikler (pzr) bilan ishlashni o'rganish. Reaksiya qo'yish

Gel-xujjatlashtiruvchi tizimda saqlash.
Faraz qilaylik, PZR reaksiyasini oʻtkazib, kerakli genning koʻplab nusxalarini hosil qildik. Yoki DNKni klonlash orqali halqasimon plazmidga kerakli genni kiritdik.
Endi PZR toʻgʻri bajarilgani yoki plazmid kerakli genni qabul qilib olganini tekshirishimiz lozim. DNK fragmentlarini vizual (oddiy koʻz bilan koʻrish orqali) tahlil qilish uchun qaysi usulni qoʻllashimiz mumkin?
Gel elektroforezi
Gel elektroforezi DNK fragmentlari (yoki RNK va oqsil singari boshqa makromolekulalar)ni oʻlchami va zaryadi boʻyicha ajratish usuli hisoblanadi. Elektroforez kerakli molekulalarni oʻz ichiga olgan gel orqali zaryad oqimini oʻtkazishdan iborat. Molekulalar oʻz oʻlchamlariga mos ravishda gel orqali turli yoʻnalishda yoki turli tezlikda bir-biridan ajraladi. 
[“Elektroforez” nomi qanday paydo boʻlgan?]
Barcha DNK molekulalari maʼlum massa birligida bir xil zaryada ega. Shuning uchun gel elektroforezi DNK fragmentlarini oʻlchamiga qarab ajratadi. Elektroforez yordamida namunada qancha turdagi DNK fragmentlari mavjudligini va ularning bir-biriga qanday bogʻliqligini bilib olishimiz mumkin. Shuningdek, DNK qismlarining oʻlchamini bilgan holda uning absolyut oʻlchamini standart “etalon” bilan solishtirish orqali aniqlashimiz mumkin. 
[Batafsil maʼlumot]
Gel nima?
Nomidan koʻrinib turibdiki, gel elektroforezi geldan – jelesimon moddadan iborat. DNK boʻlaklarini ajratish uchun qoʻllanadigan gellar koʻpincha quruq, kukunsimon shakldagi agaroza deb nomlangan polisaxariddan tayyorlanadi. Agaroza bufer eritma (ozroq tuz saqlagan suv)da qizdirilsa va sovitilsa, u qattiq konsistensiyali, biroz shilimshiq gel hosil qiladi. Molekulyar darajada olganda, gel – bu vodorod bogʻlari bilan bogʻlangan va mayda poralarni hosil qilgan agaroza molekulalarining yigʻindisi.
Gelning bir qismida quduqlar deb nomlanadigan, DNK namunalari joylashtiriladigan choʻntaksimon chuqurchalar mavjud boʻladi:

DNK namunalari qoʻshilishidan oldin gel maxsus gel qutisiga joylashtiriladi. Bu qutining bir chekkasida musbat, ikkinchi chekkasida manfiy elektrod joylashtirilgan. Qutining asosiy qismiga elektr zaryadini oʻtkazadigan tuz saqlovchi bufer eritma solinadi. Garchi yuqoridagi rasmda buni koʻrishning iloji boʻlmasa ham, bufer eritma qutiga gelni qoplaydigan darajada quyiladi.
Gelning quduqlar mavjud qismida manfiy elektrodlar joylashtirilgan. Quduqlarsiz qismida (DNK fragmentlari harakatlanadigan tomon) musbat elektrodlar joylashtirilgan.
DNK fragmentlari gel boʻylab qanday harakatlanadi?
Gel qutiga joylashtirilgach, tekshirilishi kerak boʻlgan DNK namunalari (misol uchun, PZR reaksiyasi yoki restriksion parchalash natijasida olingan plazmid) ehtiyotkorlik bilan quduqlarning biriga joylashtiriladi. Bitta quduq esa DNK chizgʻichi – maʼlum uzunlikka ega boʻlgan standart namuna uchun ajratiladi. Sanoat miqyosida ishlab chiqariladigan DNK chizgʻichlari har xil oʻlchamda boʻladi, shuning uchun biz kerakli fragmentlarni oʻlchami orqali ajratib olishimiz mumkin.
Shundan soʻng kuchlanish ishga tushiriladi va gel qutisi orqali elektr toki oʻtkazish boshlanadi. DNK molekulalari fosfat guruhi tutganligi bois manfiy zaryadga ega, shu tufayli ular gel matriksi orqali musbat qutb tomon harakatlanadi. Kuchlanish ishga tushirilib, gel orqali zaryad oʻtishi boshlanganda, gel ishlayotgan holatda boʻladi. 
[Gelni ishga tushirish uchun qanday kuchlanishdan foydalaniladi?]

DNK namunalari gelning manfiy elektrod qismidagi quduqlarga joylashtiriladi.
Kuchlanish ishga tushiriladi va DNK fragmentlari gel boʻylab (musbat qutb tomon) harakatlanadi.
Gel ishga tushgach, fragmentlar oʻlchamlari boʻyicha ajrala boshlaydi. Eng katta fragmentlar gelning yuqori qismida (dastlabki qismidagi manfiy elektrod atrofida) boʻladi, eng kichkinalari esa pastki qismida (musbat elektrod atrofida) boʻladi.
Reeceʼdagi chizmaga asoslangan.22squared
Gel ishlayotganda, uzun fragmentlarga qaraganda qisqa DNK fragmentlari gel matritsasining poralaridan tezroq oʻtadi. Gel biroz vaqt ishlagandan soʻng, DNKning eng qisqa fragmentlari gelning musbat qutbiga yaqinlashadi, eng uzun DNK fragmentlari esa quduqlar yaqinida qolib ketadi. Agar gel uzoq vaqt ishlasa, DNKning juda qisqa fragmentlari gelning chekkasidan chiqib ketishi mumkin. (Bu mening aybim bilan koʻp sodir boʻlgan!)
DNK fragmentlarining vizual tahlili
Fragmentlar ajralgandan soʻng gelni tekshirib, unda qanday oʻlchamdagi tasmalar borligini aniqlash mumkin. Gel DNK bogʻlovchi boʻyoq bilan boʻyalib, UB nurlari ostiga qoʻyilsa, gelning turli qismlarda joylashgan DNK fragmentlari yaltirab koʻrinadi.

Chizgʻichdagi har bir raqam yonidagi aj DNK fragmentida qancha asos jufti mavjudligini koʻrsatadi.
DNKning geldagi koʻzga eng yaxshi tashlanadigan “chiziqlari” tasma deb nomlanadi. Har bir tasma gelning shu qismida joylashgan bir xil oʻlchamli DNK fragmentlarini oʻz ichiga oladi. Bitta DNK fragmenti (hatto DNK fragmentlarining kichik guruhi) yolgʻiz oʻzi koʻzga koʻrinmaydi.
Namunadagi tasmalarni DNK chizgʻichi bilan solishtirib, ularning taxminiy oʻlchamlarini aniqlashimiz mumkin. Misol uchun, yuqorida tasvirlangan geldagi yorqin tasma taxminan 700700700 asos juft (aj) oʻlchamiga ega.
Mavzu boʻyicha bilimingizni sinab koʻring

Chap tomondagi oxirgi qator: bu yerda 3000 aj, 1500 aj va 500 aj tasmalarga ega chizgʻich belgilangan.
Birinchi qator: 5000 aj tasma.
Ikkinchi qator: 100 aj tasma.
Uchinchi qator: 1500 aj va 2000 aj tasma.
Toʻrtinchi qator: 500 aj tasma.
Yuqoridagi gelda toʻrtta qator raqamlangan. (Qator bu DNKning quduqdan chiqib ketadigan yoʻlagi hisoblanadi.)