Pzr uchun ishchi aralashma (master mix ) tayyorlash va termotsikler (pzr) bilan ishlashni o'rganish. Reaksiya qo'yish

Agaroz va poliakrilamid jellarining xususiyatlari:

Yoshi va sahifasi:

Agaroz: AGE uchun agaroz gelini tayyorlash kam vaqt talab qiladi, oson va sodda, va tashabbuskor yoki polimerizatsiya katalizatorini talab qilmaydi.

Poliakrilamid: PAGE uchun poliakrilamid jelini tayyorlash ko'p vaqt talab qiladigan va zerikarli, shuningdek, boshlovchi (ammoniy persulfat) va polimerizatsiya qiluvchi katalizatorni (N, N, N ', N'-tetrametiletilendiamin-TEMED) talab qiladi.

PZR va restriksiya maxsulotlarini gel-elektroforez usuli yordamida vizualizatsiya qilish.

Ishdan maqsad: PZR va restriktsiya mahsulotlarini gel-elektroforez usuli yordamida vizualizatsiya qilishni o’rganish
Kerakli asbob va jihozlar: taglik, taroqchalar, brom fenol bo’yog’i, elektroforez.
Ishning mazmuni: Gel-elektroforez usuli DNK fragmentlarini tozalash, uzunligiga qarab ajratish va identifikatsiyalashga asoslangan usuldir. Bu usulda elektr maydondagi gel ta’sirida DNK fragmentlari turli tezlikda harakatlanadi. DNK molekulalarining uglevod-fosfat qoldiqlari manfiy zaryadlanganligi uchun bo’laklar manfiy katoddan musbat anodga tomon ko’chadi.
Elektroforez gellari DNK molekulalarining o’lchamini o’lchashda, PZR (polimer zanjir reaktsiya) mahsulotlarini tahlil qilishda, molekulyar genetikada barmoq izini olishda, oldindan belgilangan DNK ni ajratishda foydalaniladi.
Ko’pchilik agarozali gellar 0,7 % dan 2 % oralig’ida tayyorlanadi.
0,7% li agaroza geli nisbatan katta bo’lgan DNK fragmentlarini (5-10kb),
2 % li gel esa kichik DNK fragmentlarini ko’rishda foydalaniladigan bo’lsa, ba’zi odamlar juda kichik bo’laklarini ko’rish uchun 3% li agarozadan ham foydalanishadi. PCRning molekulyar biologiya usuli sifatida mohiyati sharoitlarda maxsus fermentlar yordamida ma'lum bir genni (DNK bo'limi) ko'p tanlab nusxalashdan iborat. in vitro... PCR ning muhim xususiyati belgilangan shartlarga javob beradigan DNKning (genning) ma'lum bir hududining nusxalarini olishdir. DNKni nusxalash jarayonining sinonimi "amplifikatsiya" dir. DNK replikatsiyasi in vivo kuchaytirish ham hisoblanishi mumkin. Biroq, replikatsiyadan farqli o'laroq, polimeraza zanjiri reaktsiyasi jarayonida DNKning qisqa bo'limlari (maksimal 40 000 ta asosiy juftlik) kuchayadi.
Asosiy tamoyillar
Shunday qilib, PCR - bu takroriy harorat tsikllari davomida in vitroda ma'lum DNK parchalarini takroriy nusxalash. Reaksiya jarayoni bir harorat siklida qanday davom etadi?
Nukleotid zanjirining shakllanishi DNK polimeraza fermenti tomonidan amalga oshiriladi. Biroq, boshlash uchun fermentga ishga tushirish paneli kerak. Saytlar "primerlar" (primerlar) - uzunligi 15-20 nukleotid bo'lgan sintetik oligonükleotidlar. Ikkita primer (oldinga va teskari) bo'lishi kerak, ular DNK shablonining hududlarini to'ldiradi va bu DNK polimeraza tomonidan qayta-qayta nusxalanadigan primerlar bilan cheklangan DNK fragmentidir. Polimeraza ishi DNK shablonining ketma-ketligini to'ldiruvchi nukleotidlarning ketma-ket qo'shilishidir. Shunday qilib, bir harorat siklida yana ikkita yangi DNK fragmenti sintezlanadi (DNK molekulasi ikki zanjirli bo'lgani uchun dastlab ikkita matritsa mavjud). Shunday qilib, 25-35 tsikldan ortiq, primerlar tomonidan aniqlangan DNK mintaqasining milliardlab nusxalari probirkada to'planadi. Individual tsiklning tuzilishini quyidagicha ifodalash mumkin:
DNK denaturatsiyasi (erishi, DNK zanjirlarining divergentsiyasi) - 95 ° S - 1 yoki 2 minut;
primerlarning tavlanishi (primerlar DNK shabloniga bog'lanadi, bu bosqichning harorati primerning nukleotid tarkibi bilan belgilanadi) - 60 ° C (masalan) - 1 daqiqa;
DNKning cho'zilishi (polimeraza DNK zanjirini sintez qiladi) - 72 ° C - 1 minut (vaqt sintez qilingan fragmentning uzunligiga bog'liq). Laboratoriyada polimeraza zanjiri reaktsiyasi usulini qo'llash uchun instrumental asos quyidagilardan iborat bo'lishi kerak:
(yoki, shuningdek, termal tsikl deb ataladigan);
s uchun tizimlar (PZR natijalarini vizualizatsiya qilish uchun);
tizimlar (PCR natijalarini tahlil qilish uchun);
(namuna tayyorlash uchun);
terish (mexanik yoki elektron).
PCR laboratoriyasining to'liq ishlashi uchun asosiy va yordamchi uskunalardan tashqari, ba'zi sarf materiallari talab qilinadi: steril uchlar, probirkalar, probirkalar uchun tokchalar va dispenserlar.
To'liq huquqli polimeraza zanjiri reaktsiyasini o'tkazish uchun an'anaviy PCR laboratoriyasidagi reagent bazasiga buferli DNK polimeraza fermenti, primerlar (DNK shablonining tahlil qilingan hududining boshi va oxirini to'ldiruvchi kichik sintetik DNK fragmentlari) kiradi. nukleotidlar aralashmasi (A, T, D, Ts). Tozalangan suv ham mutlaqo zarurdir.
PCR usulining afzalliklari
Tadqiqotning yuqori sezuvchanligi
Usulning sezgirligi shundan iboratki, 10 5 hujayrali namunada bir marta sodir bo'lsa ham, PCRda kuchaytirish va maqsadli ketma-ketlikni aniqlash mumkin.