Pzr uchun ishchi aralashma (master mix ) tayyorlash va termotsikler (pzr) bilan ishlashni o'rganish. Reaksiya qo'yish

DNK ajratish uchun namunalar yig’ish, eritmalar va asboblarni tayyorlash.

Kerakli asbob va reaktivlar: chayqatgich apparat, sovitgichli tsentrifuga, ajratgich voronka, rN metr LPU-0,1, 100; 200 ml li o’lchov tsilindrlari, shlifli, qopqoqli kolba, pipetka, hovoncha, probirka, 37⁰С li termostat, «a» eritma-tarkibida 0,1 M EDTA, 1M dodentsilsulfat (DDS) bor, natriy xloridning 0,15 M eritmasi (rN=7,0), «b» eritma tarkibida 0,1 M EDTA, 2% DDS bor, natriy xloridning 0,15 M eritmasi (rN=6,0), «v» eritma tarkibida 0,1 M EDTA, 5% DDS bor, natriy xloridning 0,15 M eritmasi (rN=8,0), 96% li etanol, 78% li etanol, suvga to’yintirilgan fenol, fenol-xloroformning 1:1 nisbatdagi aralashmasi, NaCl ning 0,15 M va 0,015 M eritmalari, papain (tarkibida 0,005 M EDTA bor 88 mkg/ml eritma, rN=6,5), tripsin (1 mkg/ml, rN=7,2), pronaza (500 mkg/ml, rN=8,0), tripsin (375 mkg/mo); papain (50 mkg/ml), RNK-aza (50 mk/ml), tarkibida 1,5 M natriytsitrat bor 0,015 M NaCl eritmasi, tarkibida 0,001 M EDTA bo’lgan natriy atsetatning 3 M eritmasi, propanol.

O’simlik to’qimalaridan DNK ni ajratib olishda tekshiriladigan ob‘ektlarni gomogenizatsiyalash, eritmadan nukleoproteinni ekstraktsiyalash, olingan preparatni oqsilsizlantirishda qo’llaniladigan usullarni tanlash katta ahamiyatga ega. quyida o’simlik materiallaridan yuqori molekulyar DNK ajratib olishning optimal varianti keltirilgan.
Ishning bajarilishi. Suyuq azotda fiksatsiya qilingan 100 g piyozning meristema to’qimasini hovonchada bir xildagi mayin kukun hosil bo’lguncha maydalab, uning ustiga tarkibida 1 ml fenol bo’lgan 100 ml eritma qo’shiladi va yana bir xil massa hosil bo’lguncha maydalanadi. Hosil bo’lgan gomogenat 100 ml fenol bilan chayqatiladi. Tayyor bo’lgan aralashma 0⁰С da 20 minut 6000 ayl/min (10000 g) tezlikda tsentrifugalanadi. Bu vaqt tsentrifuga probirkasida 3 ta qavat hosil bo’ladi; probirka tubida fenol, uning o’rtasida oqsil va maydalangan o’simlik to’qimalari, yuqori qismi esa tarkibida DNK bor suvli qavat, o’rta qavat olinib, «a» eritma bilan yuqoridagidek ekstraktsiya qilinadi. Bu operatsiya suv qavatida DNK qolmaguncha davom ettiriladi. Shundan keyin o’simlik to’qimasining qoldig’i «b» va «v» eritmalari bilan yuqoridagicha yana ekstraktsiya qilinadi. Eritmadagi DNK ma‘lum miqdordagi ekstraktga 96% li spirt quyilganda cho’kma hosil bo’lishiga qarab aniqlanadi.
Oqsilsizlantirish. Olingan DNK ekstraktini oqsilsizlantirish quyidagicha olib boriladi. Ekstraktga teng miqdorda xloroform-fenol (1:1) aralashmasini quyib, 20 minut chayqatiladi, so’ngra yuqoridagi sharoitda tsentrifugalanadi. Tsentrifugatning suvli qavatini ajratib olib, unga ikki hajm 96% li etanol qo’shib, DNK cho’ktiriladi. Cho’kmada fenol va DDS ni yo’qotish uchun 5-7 marta 70% li etanol bilan yuviladi. Cho’kma 0,15 m NaCl da eritilgach, quyidagi usullarning biri yordamida oqsilsizlantiriladi:
1) papain (800 mkg/ml)+0,005 m EDTA (rN=6,5) bilan 37⁰С da 2 soat davomida inkubatsiya qilish;
2) tripsin (1 mkg/ml) bilan (rN=7,2) 37⁰С da 1 soat davomida inkubatsiya qilish;
3) pronaza (500 mkg/ml) bilan (rN=8,0) da xona temperaturasida bir sutka davomida inkubatsiya qilish;
4) 1 soat 37⁰С da tripsin (375 mkg/ml) bilan inkubatsiya qilish, so’ngra yuqoridagidek xloroform-fenol aralashmasi bilan ishlash. Shundan so’ng eritmadan DNK 96% li etil spirt yordamida cho’ktiriladi. Buning uchun aralashmaga 1:2 nisbatda etil spirt qo’shiladi.
5) olingan cho’kma 5-7 marta 70% li etanol bilan yuviladi. DNK cho’kmasi bufer eritmada eritiladi va papain bilan (50 mkg/ml) 37⁰С da 1 soat inkubatsiya qilinadi.
Eritmadagi DNK 96% li etanolda cho’ktirilgach, 0,15 m natriy xloridda eritiladi.
RNK va polisaxaridlardan tozalash. Buning uchun DNK eritmasining rN ko’rsatkichi NCl yordamida 5,0 ga keltiriladi. RNK-aza eritmasidan oz miqdordagi DNK-aza aralashmasini yo’qotish uchun dastlab 10 minut 80⁰С da qizdiriladi. So’ngra DNK eritmasi RNK-aza bilan (50 mkg/ml) 37⁰С da 1 soat inkubatsiya qilinadi. Shundan keyin DNK eritmasi yana fenol-xloroform aralashmasi bilan yuqoridagidek ishlanadi va DNK 1:2 hajmdagi etanol bilan cho’ktiriladi. DNK cho’kmasi tarkibida 1,5 mm natriy tsitrat bo’lgan 0,015 M natriy xlorid eritmasida eritiladi va unga tarkibida 0,001 M EDTA bo’lgan 3 M (rN=7,0) natriy atsetat (1:10) qo’shiladi. Olingan eritmaga doimo aralashtirib turgan holda tomchilatib 0,5-0,54 hajm izopropanol qo’shiladi. Bu vaqtda faqat DNK cho’kib, RNK parchalanadi va polisaxaridlar eritmada qoladi. DNK cho’kmasi 70% li etanolda 5⁰С da saqlanadi. Ajratib olingan DNK preparatlarining xossasiga qaraganda pronaza yordamida oqsilsizlantirish eng optimal variant hisoblanadi. 26-jadvalda ajratib olingan DNK ning fizik-ximiyaviy xossalari keltirilgan. 26-jadval

№	Oqsilsizlantiruvchi agent	Sedimentatsion kinstanta, (S)	Oqsil miqdori, (%)	Giperxrom effekti, (%)
1	Papain	21,2	3,0	24,0
2	Tripsin	26,8	2,1	25,0
3	Pronaza	27,5	0,93	33,3
4	Tripsin i papain	21,7	1,5	24,0