Tuproq biotasini o’rganish usullari

Uglrodning tabiiy aylanishida ishtirok etuvchi mikroorganizmlarni aniqlash
Kraxmalning parchalanishi. Kraxmalni gidrolizlovchi mikroorganizmlarni kuzatish, tuproq suspenziyasini agarli yoki kraxmal kleystiri qo’shilgan agali mihitga ekish orqali aniqlanadi. Kraxmalni gidrolizlovchi amilaza fermentini hosil qiladigan mikoorganizmlar koloniyalarining atrofi shaffof doiralar hosil bo’ladi. Agarga tuproq bo’lakchalarini qo’yish orqali, tuproqda mavjud kraxmal parchalovchi mikroorganizmlarni aniqlash mumkin. Agar chashkaga yod eritmasini quyilsa, ozuqa muhiti ko’k rangga kiradi. Yoki bo’lmasa koloniyalar atrofining qizil-qo’ngir rannga kirishi – gidroliz dekstranlargacha borganligni, yoki ularning rangsiz bo’lishi – gidroliz qandning hosil bo’lishi bilan borganligini anglatadi.
Kraxmalni parchalovchi mikroorganizlarni o’rganishga doir tajriba qo’yish. Kraxmalni aniqlash amilaza fermentining gidrolitik ta’siri natijasida parchalanishga asoslaniladi. Bunday mikroorganizmlarga turli batsillalar, psevdomonadalar, streptomitsetlar va mitselialli zamburug’lar kiradi. Amilolitik aktivlikni aniqlasha quyidagi ozuqa muhiti qo’llaniladi. Tarkibi (g/l): peptone -10,0; KH₂PO₄ – 5,0; kpaxmal eritmasi – 2,0; agar – 15,0; ozuqa muhiti pH 6,8 – 7,0 bo’lishi lozim. Ozuqa muhiti 1,0 atm.da sterillangandan so’ng, sterillangan Petri chashkalariga quyiladi. Ozuqa muhiti qotgandan so’ng, mikroorganizm ekiladi va 2-10 sutka davomida inkubatsiya qilinadi. Kraxmalning gidrolizlanishi agar plastinkasining lugol eritmasi yordamida ishlov berish orqali aniqlanadi. Buning uchun ozuqa muhit yuzasiga 2-3 ml lugol eritmasi solinadi. Kraxmal tutuvchi ozuqa muhiti, ko’k rangga bo’yaladi, agar kraxmal parchalanishidan dekstranlar hosil bo’lgan bo’lsa, gidrolizlangan zona esa qo’ng’ir-qizil rangga kiradi.
Pektinning parchalanishi. Pektin parchalovchi mikroorganizmlar o’simlik qoldiq’larini yumshatuvchi va parchalovchi – pektinaza fermentiga ega bo’ladi. Bunday fermentlarga ega bo’lgan mikroorganizmlarni aniqlash quyidagi tartibda amalga oshiriladi. Mikroorganizmlar kartoshka qaynatmasida (200 g maydalangan kartoshka bo’lklarini 1 l suvda 15 daqiqa davomida qaynatiladi va marlidan o’tkazilgandan so’ng marli yordamida suzub olinadi) 10 daqiqa davomida 24º da qaynatiladi. Undan so’ng 20-25 ml kultural suyuqlik Petri chashkasiga, ingichka kartoshka bo’lakchalri ham solinadi. Kartoshkaning matseratsiyasi 6 coat 40C da saqlangandan keyin aniqlanadi.
Pektinesteraza fermentini aniqlash uchun maxsus ozuqa muhiti qo’llaniladi. Trakibi: kartoshka bulyoni – 1000 ml; pektin -7 g; achitqi avtolizati – 5 ml; tioglikol kislotasi – 1 ml; 0,5% - bromtimol ko’ki – 1 ml. Ozuqa mihiti 0,5 atm da 30 daqiqa sterillanadi. Sterillashdan so’ng ozuqa muhiti pH 7,2-7,5 ga 10% li NaOH yordamida to’g’rilaniladi. Ekilgandan so’ng 37º da inkubatsiya amalga oshiriladi.
Tuproq mikroorganizmlarining poligalakturonaza fermantini hosil qilishi quyudagi tarkibli ozuqa muhitiga ekish orqali aniqlanadi: kartoshka bulyoni – 1000 ml; pectin – 13 g; achitqi avtolizati – 5 ml; tioglikol kislotasi – 0,5 ml; 0,004% – neytral qizili – 1 ml. Qolgan olib boriladigan ishalar pektinazani aniqlash bilan bir xil olib boriladi.
Rossi va Xolodniyning shisha yuzasida o`sish metodi. Usul “mikrob peyzajini” kuzatish imkonini beradi. Uncha katta bo’lmagan tuproq kesmasidan pichoq yordamida vertikal yoriq hosil qilinadi va unga sterillangan buyum oynasi qo’yiladi hamda ularni tuproqqa mahkam qisiladi. Preparatning joylashgan o’rni qoziq bilan belgilangandan so’ng, tuproq kesmasi ko’miladi. Agar tuproqda yetarlicha namlik mavjud bo’lsa, buyum oynasi juda tez tuproq eritmasi bilan qoplanadi. Uning yuzasiga organik va anorganik bo’lakchalar birikib qoladi. Bu joyga turli mikroorganizmlar ham yopishadi va shu tuproqqa xos mikropeyzajni hosil qiladi. Ma’lum belgilangan muddatdan (bir oydan kam bo’lmagan) so’ng, buyum oynasi tuproqdan ajratib olinadi, havoda quritiladi, olovda fiksatsiya qilinadi, juda sekinlik bilan buyum oynasi yirik tuproq bo’lakchalaridan tozalash uchun yuviladi (yoki bir necha soatga suv solingan stakanga solib qo’yish mumkin) va 1%-li karbol kislotali eritrozin bilan 1 c davomida nam kamerada bo’yaladi hamda distillangan suv yordamida yuvilgandan so’ng, quritiladi va mikroskop yordamida ko’rib chiqiladi. Bu usul yordamida birinchi marta turli mikroorganizm guruhlarining tabiiy tarqalgan joyida aniqlash imkoniyati paydo bo’ldi. Ularning formalari va turli guruhlarning o’lchamlari hamda o’zaro munosabatlarini o’rganish imkonini berdi.
Usulning modifikatsiyalangan turida, buyum oynasi tuproqqa joylanishdan avval u birob-bir ozuqa muhiti yoki qandaydir substrat (masalan, filtr qog’ozi, gazlama va bosh.) bilan qoplanadi.
Tuproq mikroorganizmlarining adsorbtsiyalanishini o’rganish. Lyuminestent mikroskopiya usulining qo’llanilishi mikroorganizm hujayrasining tuproq zarrachalariga adsobtsiyalanganligini ko’rish imkonini yaratdi. Asosan ko’pgina mikrobiologik obyektlar xususiy lyuminestsent xususiyat namoyon qilmaydi yoki kuchsiz namoyish etadi, odatda mikroorganizmlar hujyarani yaltratadigan maxsus bo’yoqlar – fluoroxrom (masalan, akridin sarig’i) yordamida bo’yaladi. Ishni bajarish vaqtidagi muhim tomonlaridan biri bu – optimal bo’yoq miqdorini aniqlash hisoblanadi. Shunday holatda hujayralar yaxshi ko’rinadi. Masalan, shunday konsentratsiyani tanlanganda, tuproq zarralari qizil rangda, unga adsorbtsiyalangan mikroorganizm hujayralari esa – yashil rangda ko’rinishi kerak. Tajribalar nurning aks qaytishiga asoslanilgan.
Ayrim hollada tuproq zarralarining yaltirab ko’rinishi, asosan tuproq monolitlarini ko’rish vaqtida, tuproq zarralarining yoppasiga yaltiragan fon hosil qilishi unga yopishgan mikroorganizm hujayralarining ko’rinishini qiyinlashtiradi. Fonning kuchli yaltirashini kamaytirish so’ndiruvchi moddalar (masalan, 0,5-1% natriy pirofosfat) qo’llanilish yordamida amalga oshiriladi.
Tuproqqa adsorbtsiyalangan mikroorganizmlarni o’rganishda skanerlovchi elektronmikroskop juda katta imkoniyat beradi. Bu usulning qo’llanilishi alohida mikroorganizm hujayrasini yoki ularning mikrokoloniyalarini ko’rish imkonini beradi.
Lyuminestsent va elektronmikroskopiya usullari yardamida olingan ma’lumotlar shuni ko’rsatadiki, mikroorganizmlar adsorbtsiyalangan holatda bo’ladi, ularni ozuqa muhitga ekish oldidan maxsus ishlov berilishi tuproq zarrasi yuzasidan desobtsiyalanishiga olib keladi.
Mikroorganizmlarning antogonistik ta’siri bu – bir mikroorganizmning ikkinchi turning o’sishiga salbiy ta’sir ko’rsatishiga asoslangan bo’lib, bir qator usullar yordamida aniqlanadi. Quyida bu usullarga to’xtalib o’tamiz.
Perpendikulyar shtrix usuli. Bunda antogonistik xususiyat namoyon qiluvchi mikroorganizm Petri chashkasi yuzasiga ekiladi (1-pasm, 1). Bu organism o’sib chiqqandan so’ng, antibiotikka chidamliligi o’rganilayotgan mikroorganizmlar esa unga perpendikulyat holatda ekib chiqiladi (1-pasm, 2-7).

1-pasm. Mikroorganizmlarning antoginistik xususiyatini perpendikulyat shtrix usuli yordamida aniqlash. 1-antogonistik xususiyat namoyon qiluvchi mikroorganizm turi; 2-7 – test, ya’ni antibiotikka chidamlilik darajasi o’rgailayotgan mikroorganizmlar.

Mikroorganizm ekilgan Petri chashkasi 20-24 soat davomida termoststda saqlanadi. Agar o’rganilayotgan mikrooganizm antoginistik xususiyat namoyon qilsa, unga perpendikulyar holatda ekilgan mikrooganizmlar uning shtrixidan uzoqroq o’sadi. Bu antagonist moddaga chidamli mikrob turi esa unga yaqin holatda o’sadi.

Agar bo’lakchalari (blochka) usuli. Bu usulda antibiotik hosil qiluvchi va test-mikroorganizmlar alohida ozuqa muhitlarida o’stiriladi. Antibiotik hosil qiluvchi aktinomitset quyidagi tarkibga ega bo’lgan ozuqa muhitida o’stiriladi (g/l): glyukoza – 30,0; KNO₃ – 5,5; MgSO₄ – 0,5; NaCl – 1,0; K₂HPO₄ – 0,4; ZnSO₄ = 0,002; agar – 25,0; distillanagan suv; pH 7,1-7,2. Ozuqa muhiti 0,5 atm sterillanadi va Petri chashkasiga quyiladi.
Agar qotgandan so’ng antibiotic hosil qiluvchi mukroorganizm butun ozuqa muhit yuzasiga gazon qilib ekiladi. Buning uchun aktinomitset sporasi bakteriologik ilmoq yordamida agar yuzasiga o’tkailadi va shpatel yordamida butun ozuqa muhiti yuzasiga yoyilib, 28 – 30 ºC da 8 – 10 kun davomida inkubatsiya qilinadi. Undan so’ng sterillangan namuna oluvchi qurilma (6-8 mm) yordamida agar bo’lakchasi olinib, bir muddat oldin test-mikroorganizm ekilgan boshqa agarli ozuqa, masalan GPA, yuzasiga o’tkaziladi. Agar bo’lakchalari shablon asosida bir-biridan teng uzoqlikda 1,5-2,0 sm masofada, chashka chetidan ichkariroqda, mitsileyi yuqoriga qaratilgan holda agar plastinkasi yuzasiga qattiq bosiladi. Antibiotikning yaxshi diffuziyalanishi uchun test-organizm ekilgan ozuqa muhitiga o’yuvchi qurilma yordamida hosil qilingan lunkalarga joylashtirilsa ham bo’ladi. Bitta test-organizm ekilgan Petri chashkasi yuzasiga turli antogonistik xususiyatga ega bo’lgan prodetsentlarni turuvchi 4-5 ta agar bo’lakchalarini joylashtirsa bo’ladi. Chashkalar antibiotiklarning ozuqaga yxshi singishi uchun 1 coat xona sharoitida saqlanadi, undan so’ng test-organizm o’sishi va rivolanishi uchun qulay bo’lgan haroratga termostatga joylashtiriladi hamda bir va uning o’sishiga bog’liq ravishda inkubatsiya qilinadi. Agar test-organizm antibiotikka sezgir bo’lsa, inkubatsiyadan so’ng agar bo’lakchalari atrofida uning o’sishini susaytiruvchi zona hosil bo’ladi. Agar test-organizm ekilgan produtsent hosil qilgan antibiotikka sezgir bo’lmasa, butun ozuqa muhit yuzasida va hatto agar bo’lakchalari atrofida ham o’sadi.
Tuproqning biologik aktivligi turli mikrobiologik (turli guruh mikoorganizmlar – bakteriyalari, aktinomitsetlar, zamburug’larning turli ozuqa muhitlarida hosil qilgan to’plamlarini sanash), biokimyoviy (tuproqning fermentativ aktivligini aniqlash, ATF, DNK), fiziologik (mikroorganizmlar biomassasini fiziologik usulda aniqlash, tuproqning nafas olishini aniqlash) va kimyoviy (nitratlar, nitritlar hamda ammyakni aniqlash) usullar yordamida aniqlanadi.
Barcha usullarni 2 guruhga bo’lish mumkin:

1. 
   tuproqning dolzarb biologik aktivligini aniqlash metodlari (dala sharoitida tuproqning nafas olishini aniqlash, azotofiksatsiya, denitrifikatsiya, ba’zi izotopga asoslangan usullar);
   
2. 
   tuproqning potentsial biologik aktivligini aniqlash usullari, laboratoriya sharoitida optimal sharoitda kechadigan protseslar (tuproqning fermentativ aktivligini aniqlash, laboratoriya sharoitida nitrifikatsiya, azotofiksatsiya, denitrifikatsiya, aktiv nafas olish kabilar).
   

Qattiq ozuqa muhitiga ekish orqali mikroorganizmlar sonini aniqlash, DNK ni aniqlash, murein kislotani aniqlash, xlorofill kabilarni aniqlash usullari faqatgina tuproqdagi mikroorganizmlaning potentsial imkoniyatlarini aniqlash imkonini beradi xolos (Zvyagintsev, 1987).