Tuproq biotasini o’rganish usullari

Suyultirilgan tuproq suspenziyasidan qattiq ozuqa muhitiga ekish metodi tuproq mikroorganizmlar sonini aniqlashning yagona va zamonaviy usullaridan emas. Masalan, Tuproq suspenziyasini lyuminestsent mikroskopiya usuli yordamida o’rganish, bakteriyalar sonini ekish orqali aniqlashdan 1000 marta oshiradi. Ammo, qattiq ozuqa mihitiga ekish orqali tuproq mikroorganizmlarni aniqlash birgina mikroorganizmlar sonini aniqlabgina qolmasdan, balki tuproq mikroorganizmlarining taksonomik tarkibini ham aniqlash bilan amaliyotda keng tarqalgan usullardan biri sifatida qolmoqda. Qattiq ozuqa muhitida o’sgan alohida koloniyadan mikroorganimlarni o’rganish va identifikatsiya qilish uchun toza kultura ajratib olish mumkin.
Tuproq namunasini olish va mikrobiologik tahlil uchun tayyorlash. O’rtacha tuproq namunasi alohida olingan namunalarni aralashtirish orqali hosil qilinadi. Bunda 100 m² maydonning 3 nuqtasidan, 100 m² dan ortiq maydonning 5 nuqtasidan, 1 ga va undan ortiq maydonning 15 nuqtasidan tuproq namunalari olinadi. Haydalma maydonlardan ularning yuza qavatidan 2 sm ochilib tuproq namunasi olinadi va tekshiriladi.
Tuproq namunasi sterillangan burg’u (bur), sterill belkurak va sterill pichoq yordamida olinadi. Buning uchun dalada namuna olish oldidan, olish uchun ishlatiladigan asbob, masalan, pichoq, yaxshilab tozalanadi va kuydidrib olinadi. Tuproq namunalari oldindan tayyorlab qo’yilgan og’zi propka bilan yopiladigan keng og’izli shisha banka, sterill polietilen yoki pergament xaltachalarga joylanadi va ularning ustiga namuna olingan joy, gorizont, sana kabi zarur ma’lumotlar yoziladi.
Tuproq namunalari bir sutka davomida analiz qilinadi. Ayrim hollarda namuna sovutgich sharoitda saqlanib, uch kun davomida tekshirish mumkin. Mikrobiologik tahlil uchun zarur bo’lgan tuproq namunasi sterillangan paketlarga olinadi. Aniq statitik natijalar olish uchun tuproq namunalari o’rganilayotgan maydonning uch-o’n joyigacha olinadi. Mikrobiologik tahlil tuproq namunasi olingan zahoti yoki namunani sovutgichning muzli kamerasida -5C saqlagan holda o’tkazilishi zarur.
Tuproq namunasini mikrobiologik tahlil uchun tayyorlash, undagi yirik o’simlik ildizlarini olib tashlash, tuproq agregatlarini maydalash, tuproq zarralari yuzasida mavjud bo’lgan mikroorganizmlarni desorbtsiyalash kabilarni o’z ichiga oladi. Tuproq namunasidagi mikroorganizmlarni desorbtsiyalash va mikrokoloniyalarni dezagregatlash namunani UZDN-1 qurilmasi yordamida ultratovush bilan quyidagi tartibda: 4 daqiqa, 0,44 A tok kuchida, 15 kGst chastotada ishlov berish zarur. Tuproqda mavjud bo’lgan mitselial organizmlarni o’rganish uchun esa, tuproq namunasi 3-5 daqiqa davomida forfor stupkada rezina mo’yqalam (pestik) yoki rezina qo’lqop kiygizilgan barmoq yordamida eziladi.
Tuproq suspenziyasini tayyorlash. Buning uchun 10 g o’rganilayotgan tuproq namunasi sterillangan chinni hovonchaga 2-3 ml sterillangan suv bilan qo’shib solinib, smetana shakliga kelguncha aralashtitiladi. Bu namunani 90 ml sterillangan vodoprovod suvi solingan kolbaga solinadi va 5 daqiqa davomida aralashtirilgandan so’ng 30 daqiqa davomida tindiriladi. Bu o’rganilayotgan tuproq namunasining birinchi suyulish darajasi hisoblanadi. Undan so’ng o’tkaziladigan suyultirish uchun sterillangan probirkalarga 9 ml dan sterillangan vodoprovod suvi solib chiqiladi. Dastlabki tayyorlangan va 1:10 marta suyultilgan namunadan 1 ml olinib keyingi probirkaga solinib aralashtiriladi, bu 1:100 marta suyulgan hisoblanadi. Undan yana 1 ml olinib keyingi probirkaga solinib aralashtiriladi, bu 1:1000 marta suyulgan namuna hisoblanadi. Xuddi shu tartibda keyingi suyultirish ishlari olib boriladi. Har bir suyultirilgan tuproq namunasidan 2-5 tagacha ozuqa muhiti solingan petri chashkalariga ekish tavsiya etiladi.
Namunani ekish. Buning uchun ozuqa muhiti solinib qotirilgan ozuqa muhiti yuzasiga sterillangan pepetka yordamida belgilangan tuproq suspenziyasidan 0,05 yoki 0,1 ml tomiziladi va Drigalskiy shpateli yordamida ozuqa muhiti yuzasiga quriguncha surtiladi. Ekilgan chashkalarga yozilgandan so’ng, qog’ozga o’raladi va qopqogini pastga qaratilgan holda termostatga inkubatsiya uchun qo’yiladi. Ekish vaqtida ochilgan chashka olovga vertikal holda tutilishi shart. Mikroorganizmlar sonini sanash ularning taksonomik guruhi va ozuqa muhit tarkibiga bog’liq bo’ladi. Go’sht peptonli agarda (GPA) 2-3 sutkada sporali va spora hosil qilmaydigan bakteiyalar aniqlanadi. Chapek ozuqa muhiti va kazein-glitserinli agarda 5-7 kunda bakteriya koloniyalari va aktinomitsetlar, suslo-agar ozuqa mihitida esa 5-7 kunda zamburug’ va achitqilar hisobga olinadi.
Tuproq mikroorganizmlarini hisoblash. 1 g tuproqdagi koloniya hosil qiluvchi (KOE) mikroorganizmlarni hisoblash, ozuqa muhit yuzasiga o’sib chiqqan koloniyalar soniga asoslaniladi. Ozuqa mihit yuzasida hosil bo’lgan har bir koloniya bu - bitta mikroorganizm hujayrasidan hosil bo’lgan deb qaraladi va shunga asoslangan holda biz 1 g tuproqdagi KOE ni hisoblashimiz mumkin. Koloniyalar sonini chashka tagidan, pastki tomonidan yoritilgan holatda sanaladi. Sanash vaqtida adashmaslik uchun, sanalgan har bir koloniyaga flamaster yoki shishaga yozuvchi qalam yordamida belgi qo’yib boriladi. Yorug’likni yaxshi o’tkazmaydigan ozuqa muhitlarda esa ustki tomondan sanash amalga oshiriladi.
Paralel ekilgan chachkalardagi koloniyalar soni sanalgandan so’ng, ularning o’rtacha soni hisoblanadi va undan so’ng 1g tuproqdagi mikroorganizmlar soni (KOE/g) quyidagi formula yordamida: A=B×V×S hosoblab topiladi. Formuladgi A – 1 g tuproqdagi mikroorganizmlar soni (KOE/g); B – chashkada o’sgan o’rtacha koloniyalar soni; V – tuproq suspenziyasining suyulish darajasi; C – ekish amalga oshirilgan tuproq suspenziyasidagi (0,05 ml yoki 0,1 ml) tomchilar sonini anglatadi.
1 ml o’rganilayotgan substratdagi hujayralar soni quyidagi formula yordamida hisoblab topiladi:

Formuladagi:
M – 1 ml dagi hujayralar soni;
a - chashkada o’sgan o’rtacha koloniyalar soni;
10ⁿ – suyultirish koeffitsenti;
V – ekish uchun olingan suspenziya miqdori, ml.
Olingan natijalarning statistik tahlili o’rtacha arifmetik xatolik, o’rtacha kvadrat xatolik, variatsion qator koifitsentini (Dmitriev, 1995) yoki STATISTIKA computer programmasi yordamida hisoblab topiladi (Manucharov va bosh., 2001).
Tuproq haydalma qatlamidagi bakteriyalar sonini aniqlash uchun GPA, Chapek ozuqa muhitiga 10^-3 va 10^-4; suslo-agar, GPA + suslo-agar, Eshbi ozuqa muhitlariga esa 10^-2 va 10^-3 daraja suyuqlantirilgan tuproq namunalari ekiladi.