DEÜ tip fakültesi
Yüklə 380,37 Kb. Pdf görüntüsü
|
- Bu səhifədəki naviqasiya:
- Anahtar sözcükler
- Tablo.
- HASTALIĞIN TANISI
- Tanı için Kullanılan Metotlar
|
Derleme
© 2012 DEÜ TIP FAKÜLTESİ DERGİSİ CİLT 26, SAYI 2 , ( AĞUSTOS) 2012, 141 - 149
Patolojik Prion Proteininin Tespiti DETECTION OF PATHOGENIC PRION PROTEIN
Murat ŞEVİK Veteriner Kontrol Enstitüsü Müdürlüğü, Moleküler Mikrobiyoloji Laboratuvarı
Murat ŞEVİK Veteriner Kontrol Enstitüsü Müdürlüğü Moleküler Mikrobiyoloji Laboratuvarı Tel: (332) 322 47 41 Faks: (332) 320 3798 Gsm: (542) 486 22 35 e-posta: dr_muratank@hotmail.com ÖZET
Bu makalede, prion hastalıklarının tanısında kullanılan güncel yöntemler hakkında bilgiler verilmektedir. Prion hastalıkları, patolojik prionların neden olduğu nörodejeneratif hastalıklardır. Patolojik prionlar (PrP Sc ), konak tarafından kodlanan prion proteininin (PrP C ), anormal izoformlarıdır. PrP C ’nin, PrP Sc ’e spontan dönüşümü, nöronlarda ve farklı dokularda (beyin dokusu, lenf bezleri ve tonsiller gibi) PrP Sc
birikimine yol açmaktadır. Prion hastalıklarının tanı yöntemlerinin birçoğu, nöronlarda ve dokulardaki PrP Sc ’nin tespitine dayanmaktadır. Güvenilir bir tanı metodunun ön koşulu, birçok örnekte PrP Sc ’i yüksek oranda tespit etmesidir. Bu amaç doğrultu- sunda, PrP Sc ’i tespit etmek için çeşitli yöntemler ve prion enfeksiyonuna duyarlı hücre hatları geliştirilmiştir. Anahtar sözcükler: Prion, insan, hayvan, nöron, tanı yöntemleri SUMMARY
This article gives information about the current methods used in diagnosis of prion diseases. Prion diseases are neurodegenerative disorders caused by pathogenic prions. Pathogenic prions are abnormal isoform of prion protein (PrP C ), is a host-encoded molecule. PrP C to PrP Sc spontaneous conversion leads to PrP Sc accumulation in neurons and different tissues (such as brain tissue, lymph nodes and tonsils). Most of the diagnostic methods for prion diseases are dependent on PrP Sc detection in neurons and tissues. High rate PrP Sc detection in many different samples is a prerequisite for a reliable diagnostic method. For this purpose, several methods and cell lines that are susceptible to prion infection have been developed for detection of PrP Sc .
Key words: Prion, humans, animals, neuron, diagnostic methods
Bulaşıcı Spongiform Ensefalopatiler (TSE) olarak da bilinen prion hastalıkları, hem insanları hem de hayvan‐ ları etkileyen ölümcül nörodejeneratif hastalıklardır. Patojenik mekanizmaları farklılık göstermekle birlikte, Hücresel Prion Proteininin (PrP C ), Scrapie İzoformu olan Prion Proteinine (PrP Sc ) konformasyonel dönüşümü bütün prion hastalıklarında ortak etiyolojik özelliktir (1). PrP
C , immun sistem hücrelerinde ve merkezi sinir sis‐ teminde, yüksek konsantrasyonlarda eksprese edilen, bir membran glikoproteindir (2,3). İnsan prion proteini, 253 amino aside sahip bir protein olarak, kromozom 20’in kısa kolunda yer alan PRNP geninde üretilir (4). PrP C ’nin mo‐
Patolojik prion proteininin tespiti 142 leküler yapısı, N ve C terminal bölgelerinden oluşmakta‐ dır. N terminal ucu, son derece esnektir ve genellikle çö‐ zünür proteininin, yapısal olmayan formu olarak şekille‐ nir. N terminal ucunun, PrP Sc ’nin β tabakasının yapılan‐ dırmasında görev aldığı düşünülmektedir. C terminal ucu ise, 3 adet α heliks ve 2 adet kısa anti‐paralel β ipliğinden oluşan globüler bir alandır (1). PrP C ’nin fonksiyonu tam olarak bilinmemekle birlikte, nöronal sinyal trans‐ düksiyon süreçlerinde ve metal metabolizmada fonk‐ siyonlarının olduğu ileri sürülmektedir (5). PrP C ve PrP Sc
izoformlarının birbirinden ayırt edilmesinde sahip ol‐ dukları moleküler yapılar dikkate alınmaktadır. PrP C ’nin %42’si α heliks, %3’ü β tabaka iken, PrP Sc ’nin %30’u α heliks, %43’ü β tabakasıdır (1). Ayrıca PrP C , proteinaz K’a duyarlı iken, PrP Sc proteinaz K’a karşı dirençlidir (3). PrP C ’nin, PrP Sc ’e spontan olarak dönüştüğü veya PrP C ’i
kodlayan gende (insanlarda PRNP geni) meydana gelen mutasyonlar sonucu, PrP Sc şekillendiği varsayılmaktadır. Fakat mutasyonlar olmadan konformasyonel değişiklikle‐ rin nasıl gerçekleştiği henüz bilinmemektedir (4). PRİON HASTALIKLARI TSE etiyolojisinde horizantal, vertikal bulaşma ve ge‐ netik predispozisyon söz konusudur. Klinik olarak hasta‐ lığın meydana gelmesinden önce aylarca veya yıllarca süren bir inkübasyon süresi gözlenmektedir (6). Hastalık, nöronal kayıp ve beyinin spongiform dejenerasyonu ile birlikte aktive olmuş astrositler ve mikroglia ile karakteri‐ zedir (7). İnsan ve hayvanlarda belirlenen prion hastalık‐ ları, Tablo’da gösterilmektedir (8). İnsanlarda prion hastalıklarının en sık görülen formu, her yaştaki ve etnik gruptaki, kadın ve erkekleri etkileyen, sCJD’dir. PRNP geninin, metionin ve valin polimorfik bölümlerinin, sporadik, iatrojenik ve variant CJD duyarlı‐ lığını etkilediği tespit edilmiştir. Kafkas nüfusunun %40 ile yapılan bir araştırmada, sCJD hastaların yaklaşık %60’ının, vCJD hastalarının %100’ünün metionin homo‐ zigot olduğu tespit edilmiştir. Bu durum, prion hastalık‐ larının kalıtsal olmayan formları arasında genetik yatkın‐ lık olabileceğini göstermektedir. sCJD’nin, genel ölüm oranı her yıl yaklaşık 1 milyon insanda 1‐2 vakadır (9).
Hastalık adı Konak Patogenez Mekanizması Kuru
İnsan Törensel yamyamlık ile enfeksiyon iCJD İnsan
Prion ile kontamine HGH, dura mater grefti ile enfeksiyon vCJD
İnsan Sığır prionları ile enfeksiyon fCJD
İnsan PrP geninde germline mutasyonlar sCJD İnsan
Somatik mutasyon veya PrP C ’nin, PrP Sc ’e spontan dönüşümü GSS İnsan
PrP geninde germline mutasyonlar FFI
İnsan PrP geninde germline mutasyonlar FSI İnsan
Somatik mutasyon veya PrP C ’nin, PrP Sc ’e spontan dönüşümü Scrapie Koyun, Keçi Genetiksel olarak duyarlı hayvanlarda enfeksiyon BSE Sığır Prion ile kontamine et ve kemik unu ile enfeksiyon TME Vizon Koyun veya
sığır prionları ile enfeksiyon CWD Katır geyiği, elk Bilinmiyor FSE
Kedi Prion ile kontamine sığır dokuları, et ve kemik unu ile enfeksiyon EUE İri ceylan, Nyala Afrika antilobu Prion ile kontamine et ve kemik unu ile enfeksiyon
Patolojik prion proteininin tespiti
Aile içinde genetik olarak ortaya çıkan fCJD oranının yaklaşık %10 ile %20 arasında olduğu ve fCJD vakalarının PRNP geninin, kodon 200 mutasyonları ile ilişkili olduğu bildirilmiştir (9,10). Ayrıca Brezilya’da bir ailede, PRNP geninin kodon 183 mutasyonunun da, fCJD’e neden ol‐ duğu tespit edilmiştir. Yapılan araştırmada, ailede 3 kuşak boyunca 17 kişinin hastalıktan etkilenmiş olabileceği be‐ lirlenmiştir (11). Britanya’da, 1995 yılında BSE ile kontamine gıdaların, insanlar tarafından tüketilmesi ile vCJD vakalarının ortaya çıktığı bildirilmiştir. Deneysel çalışmalar sonucu elde edi‐ len patolojik ve biyokimyasal kanıtlar ile vCJD ve BSE’e aynı prion ajanının neden olduğu doğrulanmıştır (12). Özellikle genç insanlarda görülen hastalığın bu formu, 20’li yaşlarında, 200 insanın ölümüne neden olmuştur (9). Nadiren de olsa, insandan insana prion hastalıklarının nakli, cerrahi aletlerin yanlış dekontaminasyonu, insan kadavra dokularından alınan biyolojik ürünlerin kulla‐ nımı ya da kan transfüzyonu ile gerçekleşmektedir (9). Bu şekilde nakledilen iCJD, ilk kez Duffy ve ark. tarafından, korneal greft uygulamasından 18 ay sonra, otopsi bulgu‐ ları ile CJD olduğu tespit edilen 55 yaşındaki bir hastada bildirilmiştir (35). Korneal greft donörünün de, CJD so‐ nucu öldüğü, otopsi sonucu ile doğrulanmıştır. O tarihten itibaren, kornea grefti ile olası CJD nakli riski bulunan 2 vaka sırasıyla, Almanya ve Japonya’da bildirilmiştir. Al‐ man hasta, korneal greft uygulamasından 30 yıl sonra 46 yaşında ölmüştür. Japon hastada da CJD varlığı, otopsi sonucu ile doğrulanmıştır (13). Epidemik bulaşıcı bir hastalık olan Kuru, 1950’lerde Papua Yeni Gine’deki, Fore kabilesinde tespit edilmiştir. Hastalığın, ritüel bir ceneaze töreni sırasında ölen insanın beyninin kafatasından çıkarılıp, pişirilip yenmesi ile in‐ sanlara bulaştığı belirlenmiştir (14). Kuru, onlarca yıl sü‐ ren (50 yıla kadar) inkübasyon süresine sahiptir (15). En yaygın ailesel TSE, GSS’dir. Genellikle hayatın üçüncü veya dördüncü on yılında meydana gelir. GSS’e neden olan mutasyon (P102L) ilk kez 1989 yılında Hsiao tarafından belirlenmiştir. Daha sonra prion protein geni‐ nin farklı kodonlarında (kodon 102, 105, 117, 145, 198) meydana gelen birçok mutasyonun da, GSS’e neden ol‐ duğu tespit edilmiştir (11,15). FFI ismi ilk kez, 1986 yılında Lugaresi ve ark. tarafın‐ dan, progresif insomni, otonomik disfonksiyon, dizartri, tremor ve miyoklonusu olan 52 yaşındaki bir hastada kullanılmıştır. Hastanın beş kuşak boyunca ki akrabaları arasında yapılan araştırmada, 7 kişinin nöropatolojik in‐ celeme sonucu FFI olduğu, 22 kişinin ise muhtemelen FFI’dan öldüğü tespit edilmiştir (11). Kalıtsal bir prion hastalığı olan FFI, PRNP geninin kodon 178’indeki missense mutasyonlar ile ilişkilendirilmektedir. Bununla birlikte, PRNP geninde mutasyon şekillenmeden de geli‐ şen, sporadik FFI vakaları bildirilmiştir (16).
Virüs ve bakteriler tarafından meydana getirilen has‐ talıklardan farklı olarak prion hastalıklarının, serolojik veya hücre kültür analizleri ve PCR gibi yöntemler ile tanımlanması güçtür. Çünkü enfeksiyöz ajan olan prionun, nükleik asit bileşeni yoktur ve normal konak prion proteininin anormal biçimi olarak meydana gel‐ mektedir. Enfekte organizma tarafından yabancı bir orga‐ nizma olarak tanımlanmadığı için, immünolojik yanıt gözlenmemektedir. Prion hastalıkları, genellikle kliniksel olarak tanımlanmakta ve beyin dokusunun post‐mortem histopatolojik analizi ile doğrulanmaktadır. Prion hasta‐ lıklarının tespitinde şuan tek güvenilir moleküler belirle‐ yici, PrP Sc ’dir. Hastalığın tanısında, PrP Sc ’nin merkezi sinir sisteminde ve lenforetiküler dokularda varlığı araştırıl‐ maktadır (6). Tanı için Kullanılan Metotlar 1.”Western Blot”: İmmünolojik bir yöntem olan “wes‐ tern blot” tekniği, beyin ve diğer dokulardaki proteinaz K dirençli, PrP fragmentlerinin tespitine dayanmaktadır. Testin prensibi, monoklonal antikorların patolojik prion‐ lara selektif olarak bağlanması ve takiben renk reaksiyonu vermesidir. Test prosedürüne göre beyin ya da omurilik parçaları homojenize edilerek, proteinaz K ile parça‐ lanmakta ve poliakrilamid jele aktarılmaktadır. Örnek elektroforetif olarak ayrımından sonra bir membrana transfer edilmekte ve monoklonal antikorlar kullanılarak kemilüminesans yardımıyla patojen prion proteinleri saptanmaktadır. Patolojik prion proteinleri, proteinaz K ile parçalanmadıklarından, protein bantları immünolojik olarak işaretlenmekte ve boyanmaktadır (6, 17).
Patolojik prion proteininin tespiti 144 “Western blot” testinde oluşan bantların yoğunluğu, protein glikolizasyonunun miktarını gösteren bir değerdir (6,18). Collinge ve meslektaşları, bant yoğunluğunun sporadik, iatrojenik ve yeni variant CJD (nvCJD)’in ayrı‐ mında kullanılabileceğini bildirmiştirler (36). Yaptıkları analizlerde, 4 tip bant oluşumunu tespit etmişlerdir. Bovine spongiform ensefalopati (BSE) ile nvCJD’nin aynı bant örneğini (tip–4), sCJD’nin tip‐1 ve tip‐2, iCJD’nin ise tip‐3 bandını gösterdiklerini bildirmişlerdir (11). “Western blot” tekniği, sodyum fosfotungstik asit ile PrP Sc ’nin presipitasyonu gibi ekstraksiyon metotları ile genişletile‐ bilmektedir. Hamster beyin homojenatında, insan sereb‐ rospinal sıvısında, beyin dokusunda ve idrarında mevcut olan düşük veya yüksek konsantrasyonlardaki, PrP Sc ’lerin
sensitivitesinin, streptomisin presipitasyonu ile dikkat çekici şekilde arttığı tespit edilmiştir (19). 2. ELISA: Bu yöntemde, monoklonal antikorla kaplı pleytlere dilüe edilmiş örnek uygulanmakta ve antikora bağlı bir deteksiyon sistemi ile PrP Sc miktarı belirlenmek‐ tedir (18). Proteinaz ile muamele işlemini içeren örnek hazırlama aşamasını, presipitasyon ve analiti zenginleş‐ tirmek için gerçekleştirilen santrifüj adımları takip eder. Renk dönüştürücü enzim ile birleşmiş antikorun kullanıl‐ dığı sandviç ELISA ile tanımlama yapılır. Tanımlama kemilüminesans ile gerçekleşir. Kemilüminesans ile ta‐ nımlamada, “cut‐off” değerleri kullanılır
(6).
Sandviç ELISA yöntemi ile 1 LD 50 (öldürücü etkili doz) BSE enfektivitesinden daha az oranda PrP Sc içeren örnek‐ lerdeki ve klinik semptom başlangıcından önce, BSE’li sığır beyinlerindeki PrP Sc varlığı tespit edilebilmektedir (18). ELISA testleri, yüksek sensivite ve spesifitiye sahip olup scrapie, BSE ve CWD’in sürveyans programlarındaki çok sayıdaki numunenin taranması için kullanılmaktadır (12).
3. İmmunhistokimya (IHC): Amiloid plak birikimi, astrogliosis ve nöral hücrelerin kaybolması gibi prion hastalıkları için tipik olan özellikler, beyin kesitlerinin, IHC analizi ile tespit edilebilmektedir (17). IHC, formalin ile fiske edilmiş, dondurulmuş ve parafine gömülü doku örneklerindeki, PrP Sc ’nin in situ belirlenmesine ve prion hastalıklarında oluşan amiloid plakların, Alzheimer gibi nörodejeneratif hastalıklarda oluşan nöritik plaklardan ayrımına, imkân sağlamaktadır (6, 20). Beyindeki, PrP immunpozitif amiloid plaklar, bazı prion hastalıkları için son derece spesifik bir tanı özelliğidir. Bütün Gerstmann‐ Sträussler‐Scheinker hastalarında ve bazı CJD hastala‐ rında, PrP immunpozitif amiloid plaklar bulunmaktadır. vCJD’de spongiform vakuoller ile çevrelenmiş florid plaklar, diğer insan prion hastalıklarında bulunmamakta‐ dır. Bu plaklar, vCJD’i diğer prion hastalıklarından ayıran bir patogenezdir. Benzer florid plakların, BSE ile enfekte maymunlarda bulunması, vCJD ve BSE’e aynı prion türü‐ nün neden olduğu hipotezinin ortaya çıkmasına neden olmuştur (6). IHC, sadece PrP Sc ’nin varlığını tespit etmez. Aynı za‐ manda PrP Sc ’nin beyin ve lenfoid dokulardaki dağılımını da ortaya çıkarır. Astrositik marker protein olan Glial Fibriller Asidik Proteine (GFAP), karşı antikorlar kullana‐ rak yapılan immunhistokimyasal boyama ile astrositik glikozun, beyin dokusundaki derecesi belirlenebilmekte‐ dir. Bazı prion türlerinin (vCJD, scrapie ve CWD), yoğun lenfotropizme sahip olması nedeniyle, immunhistokim‐ yanın TSE’lerin preklinik tanısında kullanılması öneril‐ mektedir. Yakın geçmişte yapılan bir çalışmada, IHC ile oral olarak CWD prionlarına maruz kalan bir geyiğin, lenfoid dokularında, 42 gün sonra patolojik PrP proteini saptanmıştır. Yapılan diğer bir çalışmada bir sığır, 100 gr BSE’li beyin ile oral olarak enfekte edilmiş ve farklı za‐ manlarda analizler yapılmıştır. Klinik olarak belirtilerin görülmesinden çok kısa bir süre önce histolojik olarak po‐ zitif sonuç elde edilmiş iken, immunhistokimyasal tek‐ nikler ile 6 ay önceden, PrP Sc birikimi tespit edilmiştir (6). 4. “Bioassay”: Deneysel olarak hayvanların enfekte edilerek, diagnostik ve araştırma uygulamaları ile prion türünün tanımlanmasını amaçlayan bir metottur. Bu me‐ tot ile dokulardaki PrP Sc enfektivitesi hakkında önemli bilgiler elde edilmiştir. “Biyoassay” analizleri uzun sür‐ mekte (BSE’nin, RIII faresindeki inkübasyonu 408 gündür) ve yoğun iş gücü gerektirmektedir. Sonuçları yorumlamak her zaman kolay değildir. Homolog türler arasında yapı‐ lan, “bioassay” çalışmaları en duyarlı yöntemdir. Örneğin, BSE için dana “bioassay”leri, fare “bioassay”lerinden daha duyarlıdır. Deneysel olarak enfekte edilebilecek tür çeşi‐ dinin sınırlı olması insan, koyun, geyik, elk ve büyükbaş PrP genlerini taşıyan, transgenik farelerin üretilmesini
Patolojik prion proteininin tespiti
sağlamıştır (7). Transgenik fareler, BSE prionları ile enfekte olmaya karşı, sığırlardan 10 kat, RIII farelerden 1000 kat daha duyarlı sığır PrP’leri eksprese ederler (6). Ayrıca, doğal konağa genetik yakınlıklarından dolayı inkübasyon süreleri kısalmıştır (7). Bu özellikleri trans‐ genik fareleri, insan ve sığır prionların tanımlanmasında önemli kılmaktadır (6). 5. Hücre Kültür Teknikleri: Hücre kültür modelleri, prion enfeksiyon çalışmalarında PrP Sc oluşumunun mole‐ küler mekanizmasının ve hücre otonom modelinde PrP
C ’nin, PrP Sc ’e dönüşümünde, PrP’nin amino asit dizile‐ rinin ve yapısal kısımlarının daha iyi anlaşılmasını sağla‐ mak için tasarlanmaktadır. Prion enfeksiyon mekanizması çalışmalarında, farklı duyarlı hücreler (N2a; fare nöro‐ blastoma, PC12; rat feokromositoma gibi) kullanılmak‐ tadır. Nörohipotalmik hücre olan GT1, yüksek seviye‐ lerdeki PrP C ekspresyonları gösterir ve prion hastalıkla‐ rına, diğer hücrelerden daha duyarlıdır. Priona hassas farklı hücrelerin bulunması, prion enfeksiyonlarının araş‐ tırılabileceği yeni hücre kültür modellerinin geliştirilme‐ sini kolaylaştırmaktadır. Prion enfekte beyinlerden elde edilen primer kültürler, devamlı pasajlanan hücreleri ko‐ laylıkla sağlamaktadır. Örneğin, ScHB (scrapie ile enfekte hamster beyin hücresi) ve SMB (scrapie ile enfekte fare beyin hücresi) prion ile enfekte hayvanlardan üretilmiştir. Günümüzde insan embriyonik kök hücreleri, prion hasta‐ lıklarının enfeksiyon mekanizmalarının aydınlatılmasında kullanılmaya başlamıştır (17). Enfektivite ve öldürücü etkili dozun tespit çalışmala‐ rında, hücre kültürleri de kullanılmaktadır. Prion ile enfekte hayvanların beyin homojenatları, pasajlanmadan 1‐2 gün önce kültür ortamına eklenir. Her hücrenin enfektivitesi veya PrP Sc üretimi, prion ile enfeksiyon ora‐ nına göre belirlenir. Enfektivite, hücreler intraserebral inokülasyon ile deney hayvanlarının beyinlerine enjekte edildikten sonra ölçülür. Deney hayvanları beynine en‐ jekte edilmeden önce hücreler, tekrar eden donma‐erime çevrimi ile lize edilir. 1 yıl boyunca PrP Sc tespit edilen hüc‐ reler ve hayvanlar “western blot” ile kontrol edilir. Yapı‐ lan gözlemlerden sonra LD 50 dozu, lizat enjekte edilen hayvanların hayatta kalma eğrisinden elde edilir (17). 6. Histo Blot: Bu yöntem ile anatomik doku korunarak, dokulardaki duyarlı proteinler belirlenir. Bu yöntemin bir dezavantajı, fikse edilmemiş materyale ihtiyaç duyulma‐ sıdır.
Beyindeki küçük miktarlardaki, PrP Sc ’nin tanımlan‐ ması için kullanışlı bir metottur. Taze, fikse edilmemiş beyin dokuları, nitroselüloz membran üzerinde kurutulur ve PrP C‘ i elimine etmek için proteinaz K ile muamele edi‐ lir. Guanidin hidroklorid ile proteinaz dirençli PrP Sc
Sc
belirlenir (21, 22). 7. Cell Blot: Lamel üzerinde gelişen hücrelerin, nitro‐ selüloz membrana transfer edilerek, proteinaz K dirençli PrP’lerin, “western blot” ile belirlenmesini kapsayan bir yöntemdir (17). Çoklu bağımsız hücre kültürlerindeki pri‐ on enfeksiyonlarının belirlenmesinde ve PrP Sc seviyeleri‐ nin karşılaştırılmasında duyarlı ve hızlı bir yöntemdir (23). 8. Slot Blot: Bu yöntemde, nitroselüloz membrandan hücre lizatı filtre edilir, anti‐PrP antikorlar kullanarak, proteinaz K dirençli PrP belirlenir (17). Slot blot anali‐ zinde, amiloid reaksiyonu sırasında bölünen oligomerler ile ortamda artan oluşumların belirlenmesi için spesifik prion aptameri olan SAF–93 kullanılır (24).
9. Pet Blot: İnkübasyon süresinin erken evrelerinde, PrP Sc varlığının belirlenebildiği oldukça duyarlı ve spesi‐ fik bir yöntemdir. Deneysel olarak enfekte edilen farede, intraserebral inokülasyondan 30 gün sonra, klinik belirti‐ ler ortaya çıkmadan 145 gün önce beyindeki PrP Sc varlığı, PET blot yöntemi ile tespit edilmiştir. Bu yöntemde formalinle fikse edilmiş, parafin bloklarda saklanan doku, yoğun biçimde proteinaz K ile muamele edilir ve daha sonra direkt olarak nitroselüloz membrana taşınır. Membrandaki PrP Sc , yüksek derecede duyarlık gösteren, spesifik antikorlar kullanılarak belirlenir (21). 10. Protein Misfolding Siklik Amplifikasyon (PMCA): Konsept olarak DNA’nın polimer zincir reaksiyonu ile amplifikasyonuna benzemektedir (17). PMCA teknolojisi, in vivo PrP Sc replikasyonunun hızlandırılmış sikluslarını içeren bir metotdur. Her siklus, 2 aşamadan (inkübasyon ve sonikasyon) oluşmaktadır. İlk aşamada düşük oranda PrP Sc
C içeren örnek, PrP Sc polimer‐ lerinin gelişmesini teşvik etmesi için inkübe edilir. İkinci aşamada ise polimerleri yıkmak için örneğe ultrason uy‐ gulanarak, konvertör ünitelerin sayısı artırılır. Bu 2 aşama,
Patolojik prion proteininin tespiti 146 her siklusta uygulanarak, elde edilen PrP Sc miktarı artırılır (25). Siklik amplifikasyondan sonra örnekte yeni şekillen‐ dirilen proteinlerin, %97’sinden fazlası PrP Sc olduğu tespit edilmiştir (26). Dokulardaki ve biyolojik sıvılardaki belirlenemeyen, prion proteinleri ile enfekte presemptomatik hamsterların kanındaki prion bu yöntem ile tespit edilmiştir (17). Ay‐ rıca süt ve idrar gibi çeşitli sekresyonlardaki ve hayvanlar tarafından kontamine edildiği varsayılan toprak ve sudaki PrP Sc
11. Konformasyon Bağlı İmmunassay (CDI): Bu yön‐ teminde, PrP Sc ‘i selektif olarak çökeltmek için, doku homojenatları sodyum fosfotungstik asit ile inkübe edilir. PrP
C ve PrP Sc ’i birbirinden ayırmak için denatürasyon, proteinaz K yerine
guanidin hidroklorid ile yapılmaktadır (27). Tespit edici antikor, enfekte olmamış formda (PrP C ) her zaman görülen ama enfeksiyoz formun (PrP Sc ) sadece denatürasyon sırasında görülen, konformasyon bağımlı epitopu (antijen molekülündeki kimyasal uç yapılar) be‐ lirlemek için kullanılır. Antikor bağlanma miktarı, denatüre PrP Sc ve doğal PrP Sc arasındaki sinyal farklılıkla‐ rına bağlı olarak değişir. Sinyal farklılıkları, doku homo‐ jenatlarındaki PrP Sc ’nin tanımlayıcı bir kriteri olarak kul‐ lanılır (6).
12. Genişletilmiş Disosiyasyon Lanthanide Floresan İmmunassay (DELFIA): Bu yöntemde, guanidin hidro‐ klorür ile PrP Sc ekstraksiyonu gerçekleştirilir (17). PrP’i çözündürmek için guanidin hidroklorür, iki farklı konsantrasyonda uygulanır. Serbest PrP, monoklonal an‐ tikor ile yakalanır. Monoklonal antikor ve PrP kompleksi, europium ile işaretlenmiş olan antikorlar ile belirlenir. Zaman ayrımlı floresans kullanarak, iki farklı konsantras‐ yonda (çözünen ve çözünmeyen) hazırlanan örneğin kantitasyonu yapılır (28). Çözünmeyen PrP’nin, total PrP konsantrasyonuna oranı bu yöntem için belirleyici bir kriterdir (17). Bu yöntem ile 10 pikograma kadar PrP be‐ lirlenebilmektedir (28). 13. Kapiller Jel Elektroforez: Floresan işaretli sentetik PrP peptid ile doku örneklerinde mevcut olan PrP’nin, antikora bağlanmak için yaptıkları mücadeleyi belirle‐ meye dayanan bir yaklaşımdır. Serbest peptid ve antikor peptid pikleri, kapiller elektroforez ile birbirlerinden ayırt edilmektedir (17). Ultrasantrifügasyon yöntemleri ile be‐ yinden ekstrakte edilen prion proteini, sodyum lauroyl sarkozin ve proteinaz K ile muamele edilir. Son santrifüj‐ den sonra elde edilen pelet, süspanse edilerek, sodyum dodesil sülfat ve 2‐merkaptoetanol ile muamele edilir ve kaynatılırarak, elektroforez işlemine tabi tutulur. Schmerr ve ark. yaptıkları çalışmada bu yöntemin, scrapie teşhisi için “western blot” yöntemine göre yaklaşık 100 kat daha az örnek miktarına ihtiyaç duyduğunu bildirmişlerdir (29). 14. Floresan Korelasyon Spektroskopi (FCS): Solüsyon içinde lazer ışınları arasından geçen, floresan işaretli mo‐ lekülleri belirlemeye dayanan bir metottur. Analiz solüs‐ yonu, PrP Sc agregatlarına kuvvetli bir şekilde bağlanan, flüorofor ile işaretli anti‐PrP antikorlarını içermektedir. Anti‐PrP antikoru veya rekombinant PrP ile işaretlenmiş PrP
, rölatif floresan yoğunluğuna göre tespit edilir (17, 18). Anti‐PrP antikorları bağlanan PrP Sc , monomerik PrP C ’nin arka planında kolayca görülebilmektedir. Bu metodun, “western blot” metodundan yaklaşık 20 kat daha duyarlı olduğu bildirilmiştir. CJD hastalarının %20’sinin serebrospinal sıvısında ilk kez bu yöntem ile PrP
Sc tespit edilmiştir (18). 15. Multispektral Ultraviyole Floresan Spektroskopi (MUFS): Bu yöntemde proteinler, ultraviyole radyasyon ile uyarılarak, spesifik floresan emisyon tarzlarına göre belirlenirler. Bu şekilde hücresel prion proteinini, patolojik prion proteininden ve farklı PrP Sc formlarından ayırmak mümkün olmaktadır (18). 16. Aptamer: Aptamer, spesifik biçimde hedef proteine bağlanan DNA veya RNA molekülleridir (17). PrP C
ve/veya PrP Sc ’nin de, kimyasal olarak sentezlenen, stabi‐ lize ve mobilize edilen spesifik nükleik asit aptamerlerinin olduğu bildirilmiştir (30). Weiss ve ark. (1997) yaptıkları çalışmada, G kuartet motiflerine sahip RNA aptamer‐ lerinin, PrP’nin amino ucuna bağlandığını tespit etmiş‐ lerdir (31). İn vitro prion analizlerinde, PrP Sc ’nin spesifik bağlanma aptamerinin, PrP’nin proteinaz dirençli form‐ larının bir araya gelmesini engellediği belirlenmiştir (17). Bu tespite dayanarak, RNA, DNA ve peptid aptamerle‐ rinin, prion hastalıklarının tanısında ve tedavisinde yararlı olabileceği düşünülmektedir (30). 17. Fourier Transform İnfrared (FT‐IR) Spektroskopi: Patolojik prion proteininin tespiti
Kan ve nöronol dokudaki patolojik prion proteinin, belir‐ lenmesi için umut veren bir biyofiziksel yöntemdir (32). Bu yöntem, infrared spektrumundaki çok değişkenli ana‐ lizlerin birleşmiş olduğu tanımlayıcı bir metottur (17). FT‐ IR ile prion proteinlerinin üç boyutlu yapısı belirlenmek‐ tedir. Pan ve ark. bu yöntemle yaptıkları çalışmada, PrP C
iken PrP Sc ’nin %30’unun α heliks, %43’ünün β‐sheet for‐ munda olduğunu tespit etmişlerdir (37). Gasset ve ark. PrP
Sc ’nin, proteinaz dirençli çekirdeği olan PrP27‐30’un, %54’ünün β‐sheet, %25’inin α heliks yapısında olduğunu bildirmişlerdir (38). FT‐IR ile PrP Sc ve PrP27‐30 karak‐ terizasyonunun yapılabilmesi, antikorlardan bağımsız olarak, memeli türü ve spesifik TSE kısıtlamaları olmadan, moleküler suş tiplemesinin bu yönteminle yapılmasına imkan vermektedir (32). 18. “Flow Microbead Immunoassay” (FMI): Mikro‐ boncuklara kovalent olarak bağlanmış anti‐PrP antikorla‐ rının kullanıldığı bir metottur (17). Mikro‐boncuklar ile bloklanan örneklerin, floresan yoğunluğu, “flow
cytometer” ile belirlenir. Floresan yoğunluğu, PrP Sc kon‐ santrasyonu ile doğru orantılı olarak artış gösterir (33). Bu metot ile sığır etindeki 7 pmol / 7 nmol ve kemik unun‐ daki %0,3’den daha yüksek konsantrasyondaki rekombi‐ nant PrP/ PrP Sc belirlenebilmektedir (17). 19. Biomarkerlar: PrP Sc , TSE’nin post‐mortem tanısı için uygun bir işarettir. Çünkü enfekte insanların ve hay‐ vanların Santral Sinir Sistemlerinde (SSS) yüksek konsant‐ rasyonda, PrP Sc bulunmaktadır. Bununla birlikte, PrP Sc
preklinik tanıda sınırlı olarak kullanılabilmektedir. Çünkü PrP Sc , SSS dışında, özellikle vücut sıvılarında (kan, idrar gibi), oldukça düşük konsantrasyonda bulunmaktadır. Prion ile enfekte insanların ve hayvanların idrarlarında, proteinaz dirençli PrP kökenli moleküller belirlenmiştir. Fakat güvenilir rutin bir test henüz geliştirilememiştir (6). Farklı RNA görüntüleme teknolojileri kullanılarak, yeni bir transkriptin eritroid farklılaşma faktörünü kodla‐ dığı (EDRF) ve bu faktör ekspresyonunun scrapie ile enfekte farede, hastalığın gelişimi sırasında aşamalı olarak azaldığı belirlenmiştir. BSE ile enfekte büyük baş serumla‐ rında belirlenen nükleik asitlerin, hastalığın gelişimi ile beraber ortaya çıktığı ile ilgili benzer yaklaşımlar bulun‐ maktadır (6). 20. Elektrokardiyografi (EKG): TSE’lerin tanısındaki diğer bir invazif olmayan test, yüksek çözünürlükteki elektrokardiyografidir. EKG ile enfeksiyonun erken saf‐ halarında kalp hızında belirgin değişimlerin olup olma‐ dığı araştırılmıştır. EKG, deneysel olarak BSE ajanı ile enfekte edilen 150 sığırda denenmiş ve 8 ay sonra ölen 2 hayvanda Solunum Sinüs Aritmi (SSA) seviyelerinin art‐ masına bağlı olarak, hastalık tespit edilmiştir (6). 21. Elektroensefalogram (EEG): EEG uygulaması ya‐ pılan CJD hastalarının %75‐85’inde, hastalığın ileri aşa‐ malarında tipik tanısal bulgular elde edilmiştir. Tipik EEG bulgusu periyodik, bifazik veya trifazik, senkronize keskin dalga kompleksleridir (11). Hastalığın erken evre‐ sinde, EEG ile yaygın düzensiz teta ve delta dalgaları ile birlikte bilateral alfa ve aralıklı yüksek amplitüdlü ritmik delta aktivitesinin tespit edilebileceği bildirilmiştir (10). 22. Manyetik Rezonans Görüntüleme (MRI): CJD tanı‐ sında, difüzyon ağırlıklı MRI görüntülemenin en duyarlı teknik olduğu düşünülmektedir. T2 ağırlıklı MRI ile bazal ganglion anormallikleri belirlenebilmektedir. vCJD’li hastalarda, MRI ile talamusun pulvinar çekirdeğinde, bilateral sinyal artışı tesptit edilmiştir. Bu bulgu, vCJD için %78 oranında duyarlı ve %100 oranında özgül bir bulgu olarak değerlendirilmektedir (34). SONUÇ Mevcut tanı yöntemleri, PrP C ve PrP Sc proteinleri ara‐ sındaki fizikokimyasal farklılıklara dayanmaktadır. Tanı yöntemleri arasındaki temel faklılık, saptama seviyelerin‐ den kaynaklanmaktadır., Hastalığın preklinik safhasında PrP
Sc birikiminin düşük bir kinetiğe sahip olması, tanı yöntemlerinin inkübasyon periyodunun erken safhala‐ rında kullanılmasını sınırlandırmaktadır. Bu kısıltlamalar dikkate alınarak, yeni diagnostik tekniklerde, PrP Sc ’nin tanımlanması için vücut sıvılarındaki duyarlılığın ve spesifitenin artırılması ve PrP Sc varlığını temsil eden yeni göstergelerin belirlenmesi hedeflenmektedir (6). KAYNAKLAR 1.
Ji HF, Zhang HY. Beta-sheet constitution of prion pro- teins. Trends Biochem Sci 2010; 35: 129-134. 2.
prion infection in variant Creutzfeldt-Jakob disease: a Patolojik prion proteininin tespiti 148 blood-based assay. Lancet 2011; 377: 487-493. 3.
Paternain B, Moleres FJ, Ferrer V. Cellular prion protein in the central nervous system of mammals. Anatomoclinical as- sociations. Neurologia 2010; 25: 228-233. 4.
469-480. 5.
Van der Kamp MW, Daggett V. Pathogenic mutations in the hydrophobic core of the human prion protein can promote structural instability and misfolding. J Mol Biol 2010; 404: 732-748. 6.
ases. Br Med Bull 2003; 66: 267-279. 7.
Gavier-Widén D, Stack MJ, Baron T, Balachandran A, Simmons M. Diagnosis of transmissible spongiform en- cephalopathies in animals: a review. J Vet Diagn Invest 2005; 17: 509-527. 8.
13383. 9.
Pocchiari M, Poleggi A, Principe S, Graziano S, Cardone F. Genomic and post-genomic analyses of human prion diseases. Genome Med 2009; 1: 63. 10.
Zerr I. Clinical and therapeutic aspects of prion disease. Handb Clin Neurol 2008; 89: 737-764. 11.
Belay ED. Transmissible Spongiform Encephalopathies In Humans. Annu Rev Microbiol. 1999; 53: 283-314. 12.
Cook RW, Richards RB, Middleton DJ. Transmissible Spongiform Encephalopathies. Australian and New Zealand Standard Diagnostic Procedure 2010; 16. 13.
of Prion Diseases. Annu Rev Public Health 2005; 26: 191–212. 14.
tious Particles, JIACM 2003; 4: 334-336. 15.
McKintosh E, Tabrizi SJ, Collinge J. Prion diseases. J. Neurovirol 2003; 9: 183–193. 16.
Wadsworth JDF, Collinge J. Update on human prion disease. Biochimica et Biophysica Acta 2007; 1772: 598– 609.
17.
Sakudo A, Nakamura I, Ikuta K, Onodera T. Recent developments in prion disease research: diagnostic tools and in vitro cell culture models. J Vet Med Sci 2007; 69: 329-337. 18.
Ingrosso L, Vetrugno V, Cardone F, Pocchiari M. Molecular diagnostics of transmissible spongiform en- cephalopathies. Trends Mol Med 2002; 8: 273-280. 19.
PrP (Sc) by Western Blot Assay Based on Streptomycin Sulphate Precipitation. Zoonoses Public Health, 2007; 54: 328-336. 20.
Kretzschmar HA, Ironside JW, DeArmond SJ, Tateishi J. Diagnostic criteria for sporadic Creutzfeldt-Jakob dise- ase. Arch Neurol 1996; 53: 913-920. 21.
paraffin-embedded tissue blot detects PrPSc early in the incubation time in prion diseases. Am J Pathol 2000; 156: 51-56. 22.
Taraboulos A, Jendroska K, Serban D, Yang S-L, DeAr- mond SJ, Prusiner SB. Regional mapping of prion pro- teins in brain. Proc Natl Acad Sci 1992; 89: 7620-7624. 23.
susceptible to prion infection. J Virol 2000; 74: 4377- 4386.
24.
Tahiri-Alaoui A, Sim VL, Caughey B, James W. Molecu- lar heterosis of prion protein beta-oligomers. A potential mechanism of human resistance to disease. J Biol Chem 2006; 281: 34171–34178. 25.
Soto C, Saborio GP, Anderes L. Cyclic amplification of protein misfolding: application to prion-related disorders and beyond. Trends Neurosci 2002; 25: 390-394. 26.
pathological prion protein by cyclic amplification of pro- teinmisfolding. Nature 2001; 411: 810-813. 27.
immunoassay to measure PrP Sc levels in scrapie-in- fected sheep brains reveals PrP genotype-specific differ- ences. J Immunol Methods 2005; 298: 119-128. 28.
Dabaghian RH, Barnard G, McConnell I, Clewley JP. An immunoassay for the pathological form of the prion pro- tein based on denaturation and time resolved fluorome- try. J Virol Methods 2006; 132: 85-91. 29.
Schmerr MJ, Jenny A, Cutlip RC. Use of capillary so- dium dodecyl sulfate gel electrophoresis to detect the prion protein extracted from scrapie-infected sheep. J Chrom B Biomed Sci Appl 1997; 697: 223-229. 30.
Gilch S, Schätzl HM. Aptamers against prion proteins Patolojik prion proteininin tespiti
and prions. Cell Mol Life Sci 2009; 66: 2445-2455. 31.
Weiss S, Proske D, Neumann M, et al. RNA Aptamers Specifically Interact with the Prion Protein PrP. J Virol 1997; 71: 8790–8797. 32.
Lasch P, Naumann D. Analyti- cal applications of Fourier transform-infrared (FT IR)
spectroscopy in microbiology and prion research. Vet
Microbiol 2007; 123: 305-319. 33.
Murayama Y, Yoshioka M, Horii H, Takata M, Miura K, Shinagawa M. Specific detection of prion antigenic determinants retained in bovine meat and bone meal by flow microbead immunoassay. J Appl Microbiol 2006; 101: 369-376. 34.
Creutzfeldt-Jakob disease: Comparative Analysis of MR Imaging Sequences. ANJR Am J Neuroradiol 2006; 27: 1459-1462. 35.
Duffy P, Wolf J, Collins G, DeVoe AG, Streeten B, Cowen D. Possible person-to-person transmission of Creutzfeldt-Jakob disease. N Engl J Med 1974; 290: 692- 693. 36.
Collinge J, Sidle KC, Meads J, Ironside J, Hill AF. Molecular analysis of prion strain variation and the aetiology of ‘new variant’ CJD. Nature 1996; 383: 685- 690. 37.
Pan KM, Baldwin M, Nguyen J, Gasset M, Serban A, Groth D, Mehlhorn I, Huang Z, Fletterick RJ, Cohen FE, Prusiner SB. Conversion of -helices into ß-sheets features in the formation of the scrapie prion proteins. Proc Natl Acad Sci USA 1993; 90: 10962-10966. 38.
Perturbation of the secondary structure of the scrapie prion protein under conditions that alter infectivity. Proc Natl Acad Sci USA 1993; 90: 1-5.
Yüklə 380,37 Kb. Dostları ilə paylaş:
|