Trombin generáció fluorimetriás követésére alkalmas szubsztrátok fejlesztése Kern Anita

Trombin generáció fluorimetriás követésére alkalmas szubsztrátok fejlesztése

Kern Anita, IV. évf. vegyészmérnök

BME Vegyészmérnöki és Biomérnöki Kar

Témavezetők: Dr. Fekete Jenő egyetemi tanár

BME Szervetlen és Analitikai Kémia Tanszék

Dr. Antal József fejlesztőmérnök

Diagon Kft.

A klinikai gyakorlatban a véralvadási folyamatok egyensúlyát alvadási tesztekkel jellemzik (pl. protrombinidő), ezek azonban nem adnak teljes képet a véralvadás kulcs enzime, a trombin aktivitásának változásáról a folyamat egésze során. Erre a célra szolgál a trombin generáció (TG) felvétele, mely a trombin felszabadulását követi az idő függvényében. A trombin generációban eddig használatos kromogén és fluorogén szubsztrátok nem rendelkeznek a trombin specificitását döntően meghatározó C-terminális peptid résszel, így a szelektivitásuk nem kielégítő.

A munka célja, hogy RP-HPLC analitika segítségével olyan teljes hosszúságú peptid szekvenciá(ka)t találjunk, mely(ek) a lehető legszelektívebben reagál(nak) a trombinnal. A kapott peptidgerincre intramolekuláris fluoreszcenciakioltáshoz szükséges csoportokat kapcsolva szelektív és érzékeny szubsztrátot kaphatunk. A munka első lépése két lehetséges peptid szekvencia kiválasztása többszörös szekvenciaillesztés (multiple alignment) alkalmazásával. A csak az N-terminálisukon különböző (valin, illetve triptofán) peptideket megszintetizáltattuk, majd a peptidek trombin specificitását aktivált protrombin komplex koncentrátummal (aPCC) teszteltük. Számottevő preferencia különbséget nem tapasztaltunk. Így távlati céljainknak (intramolekuláris fluoreszcencia kioltás elvén működő szubsztrát) megfelelően a továbbiakban a triptofános változattal dolgoztunk. Fibrinogén mentes, antikoagulánsokat nem tartalmazó enzim rendszer, a PCC aktiválását követve modelleztük a trombin generáció prokoaguláns szakaszát. A modellrendszerrel kapott eredmények szerint a peptid szubsztrát „lassabb” mint a hasonló kromogén szubsztrát, a lassúbb működés a trombin generáció szempontjából kedvező. A munka következő lépése a szubsztrátok tesztelése konkurens enzimekkel (faktor Xa, faktor VIIa), továbbá humán vérplazmán. A specificitási tesztek utolsó lépéseként pedig egészséges és beteg vérmintákban mérjük a trombin generációt.