03. Gidalarda Bulunan Mikotoksinler ve Üretici Funguslari >04. Mikotoksinlerin Canlilara Etkileri

7. Mikotoksinlerin Belirlenmesi

Mikotoksinlerin gida ve yemlerde belirlenmesi için günümüzde hassas ve güvenli birçok yöntem bulunmaktadir. Mikotoksinler içinde en önemli konumda olan aflatoksinlerin belirlenmesinde kullanilan yöntemlerin bile tümünü bütün detaylariyla burada anlatmak olanaksizdir. Kaldi ki zaman içinde her mikotoksinin kendi özelliklerinden yola çikilarak gelistirilen özel analiz yöntemlerinin de sayisi az degildir. O nedenle burada aflatoksinin klasik olarak ince tabaka kromatografisi ile analizinden ve son yillarda mikotoksinler için gelistirilen immunokimyasal test kitlerinden ve hizli testlerden söz edilecektir. Aflatoksinin belirlenmesinde; ince tabaka kromatografisi, gaz kromatografisi, yüksek basinçli sivi kromatografisi (HPLC) yöntemlerinden ve teknige bagli olarak mass spektrometreden yararlanilir. Kromatografi; bir karisimda bulunan maddelerin, sabit faz ile onun üzerinde hareket eden bir faza olan affinitelerinin farkliliklari nedeni ile, hareketli fazda farkli hizda tasinmalarina bagli olarak birbirlerinden ayrilmalarini saglayan bir yöntemdir. Kromatografide kullanilan sabit ve hareketli fazin sivi, kati veya gaz olmalarina göre; sivi/sivi, kati/sivi, kati/gaz veya sivi/gaz fazli kromatografik yöntemler gelistirilmistir. Ince tabaka kromatografisinde kati/sivi fazlar kullanilir.

Aflatoksin ister rutin olarak, isterse HPLC gibi gelismis aletlerde kantitatif olarak belirlensin belli ön islemler yapilmasini gerektirir. Numune almadan baslayarak saptanan aflatoksinin dogrulanmasina kadar her asama önemlidir. Aflatoksin belirlenmesinde su islemler sirayla yapilmalidir.

Numune alma  Yagdan arindirma  Ekstraksiyon  Ekstrakt temizleme  Konsantrasyon  Kromatografik ayrim  Teshis, Tayin  Dogrulama

Ürünün yapisina bagli olarak bu islemlerin hepsi gerekebilir, veya bazi basamaklar kullanilmayabilir ya da ek islemlere gereksinme duyulabilir. Öncelikle numunenin dogru alinmasi ve isleme hazirlanmasi gerekir. Asp. flavus enfeksiyonunun düzensiz olusu, fistik ve hububat gibi daneli ürünlerde partilerin yüksek konsantrasyonlu aflatoksin kontaminasyonu içeren cepler olusturmasi temsili numune alimini zorlastirir. Akis halindeki üründen örnek alimi daha kolaydir. Ayni partiden alinan örneklerde yapilan aflatoksin analizleri birbirinden çok farkli sonuçlar gösterir. O nedenle özellikle yer fistiginin örnekleme yöntemi üzerinde çok çalisilmistir. Numunenin hacmi ve tüm partiyi temsil etmesi çok önemlidir. Iyi bir örnekleme planina göre ürünün cinsine bagli olarak 0.5-20 kg arasinda örnek alinir. Analize alinan örnegin miktari ise 50-100 g arasinda degisir. Ender olarak özel nedenlerle bu miktar 1 kg' a kadar yükselebilir. Partiden alinan numunenin homojen hale getirilmesi ve analiz için ayrilan miktarin tüm numuneyi temsil etmesi de büyük önem tasir. % 5' in üzerinde yag içeren ögütülmüs ve homojen hale getirilmis örnegin yagdan arindirilmasi gerekir. Yalniz bazi yöntemlerde toksin ekstraksiyonu sirasinda yag da ayni anda ekstrakte oldugundan bu basamaga gerek kalmayabilir. Aflatoksinin gidadan alinmasi organik bir solvent ile ekstraksiyonu sonucunda mümkün olur. Bu amaçla uygun çözücü olarak yönteme bagli olarak kloroform, diklormetan, metanol, aseton veya asetonitril kullanilir. Ekstraksiyonda diatome toragindan yararlanan yöntemler de vardir. Böyle bir yönteme göre numune, damitik su, diatome topragi ve metanol birlikte mekanik bir çalkalayicida yaklasik 30 dk kadar ekstrakte edilir. Ekstraksiyon süresinin sonunda süzülerek kloroform fazi ayrilir.

Kloroformla ekstrakte edilmisse süzülen kloroform fazinin, diger çözücüler kullanilmissa o çözücü fazlarin pigmentlerden, floresan veren yabanci maddelerden veya yagdan arindirilmasi gerekir. Aksi taktirde bu maddeler kromatografik ayrim ve tayin asamasinda sorun ve yanilgilara neden olurlar. Ekstrakt temizlenmesinde kolon kromatografileri, sivi-sivi dagilimi ve çöktürme yöntemleri kullanilabilir. Kolon kromatografisi ile temizlemede önce kolonun dip kismina gevsek olarak cam pamugu yerlestirilir. Silikajel doldurulmadan önce silikajele taban olmak üzere bir miktar sodyum sülfat konur, kolon önce kloroform ile yikanir sonra yarisina kadar kloroform ile doldurulur ve silikajel kolona bosaltilir. Kolon kenarlari tekrar kloroform ile yikanir ve silikajel karistirilarak çökmesi (oturmasi) için birakilir. Silikajel daima kloroform içinde olacak sekilde akis sürdürülür. Silikajelin çökmesinden sonra kolona önce sodyumsülfat ilave edilir, sonra temizlenecek olan örnek ekstrakti (süzülen kloroform fazi) konur ve zamani geldiginde hegzan kolona dökülür. Son olarak da dietileter ilave edilir. Eterin akisi bittikten sonra kolondan temizlenmis aflatoksinleri almak için kloroform-metanol karisimi kullanilir. Temizlenen ekstrakt kolonun muslugundan alinir ve su banyosunda buharlastirilarak kurutulur. Tekrar kloroformla yikanarak bir vial içerisine alinip agzi sikica kapatilarak buz dolabinda ince tabaka kromatografi plakalarina uygulanmak üzere saklanir.

Kromatografide itina ile hazirlanmis silikajel kapli plakalar veya hazir kromatografi plaklari kullanilabilir. Vial içindeki aflatoksin içerdigi düsünülen ekstrakt plaka üzerinde önceden isaretlenmis olan yerlere siringa ile belli miktarlarda (2.5; 5.0; 10  l) tatbik edilir. Rezolusyon referens standardi ve AFB₁ basta olmak üzere aflatoksin standartlari da uygulanir. Plak, kromatografi tankinda içinde kloroform-aseton çözücü solvent içinde, tankin agzi kapatilarak, oda sicakliginda 40 dk gelistirilir (Rf=0.4-0.7 degerlerine ulasacak sürede). Tanktan alinan plaka (kromatogram) oda sicakliginda kurutulur ve UV lambasi altinda incelenir. Plaka üzerindeki benekler azalan Rf degerlerine göre B₁, B₂, G₁ ve G₂ toksinleridir. B₁ ve B₂ mavi floresan verirken G₁ ve G₂ yesilimsi renkte floresan verir. Standart beneklerin numune ekstraktinda bulunan maddelerle örtülmesi deneyin tekrarina neden olur. Tekrarlanan analizde yabanci floresan veren maddelerin uzaklastirilmasi amaciyla plaka önce susuz dietileterde, eterin uçurulmasinin ardindan normal çözücü (Kloroform-aseton) kullanilarak ayni yönde tekrar gelistirilir. Bu da yeterli olmazsa iki boyutlu ince tabaka kromatografisi uygulanir. Numuneye ait aflatoksin oldugu tahmin edilen benek ile standarda ait benek üst üste geldiginde tek benek olusmalidir. Standartla ayni Rf degeri ve ayni renk floresan veren benegin tespiti ile aflatoksin kalitatif olarak belirlenmis olur. Aflatoksinleri mevcut olabilecek diger floresan maddelerden ayirabilmek için kimyasal dogrulama testi yapilir. Bunun için genellikle beneklerin üzerine % 25' lik H₂SO₄ ince zerrecikler halinde püskürtülür. Süpheli benekler standartlar gibi UV altinda parlak sari renge dönüsmelidir. Triflorikasitle de AFB₁ ve AFG₁' in dogrulanmasi ayri bir uygulama ile yapilabilir.

Kantitatif analizde, analizde kullanilan standart hacmi ve konsantrasyonu, numune ekstraktinin son seyrelti hacmi ve tatbik edilen hacmi, vial içindeki ekstrakta esdeger numune miktari dikkate alinarak formülden hesaplanir.

AFB₁ ( g.kg^-1) =(S.Y.V) / (E.M)

S = Bilinmeyene esdeger AFB₁ standardi ( l)

Y= AFB₁ standardi konsantrasyonu ( g. l^-1)

V= Numune ekstraktinin son seyreltildigi hacmi ( l)

E=AFB₁ standardina esdeger miktarda floresan yogunlugu gösteren numune benegi için tatbik edilen numune ekstrakti ( l)

M= Vial içindeki ekstrakta esdeger olan numune (g).

Aflatoksin analizinde ayrica rutin taramalar için gelistirilmis olan kisa sürede (kurulu bir laboratuvar düzeninde 15-20 dk) sonuç veren minikolon veya fluorisil yöntemleri de bulunmaktadir. Fluorisil tüp yönteminde fluorotoksinmetre aletine ihtiyaç vardir. Aletin bulunmadigi laboratuvarda kolon uzun dalga boylu 360 nm UV isigi altinda incelenip degerlendirilir.

Bazi ürünler için kullanilan efektif bir yöntem ise; 365 nm de UV isigi altinda tohum ve danelerin incelenerek parlak yesilimsi ve sari yesilimsi floresan renk verenlerin ayrilmasidir. Bu yöntem için otomatik aletler de gelistirilmistir. Parlak yesilimsi-sari renge üründe bulunan kojik asit neden olur. Ancak aflatoksin üreten Aspergillus suslarinin % 90' dan fazlasi es zamanli olarak kojik asit ürettiginden, parlak floresan renk ile aflatoksin kontaminasyonu arasinda yüksek korelasyon saptanmistir. Aflatoksinin varligini indirekt gösteren bu yöntem yer fistigi ve pirinç için uygun bulunmamistir. Ancak unutulmamasi gereken husus floresan vermeyen danelerin de düsük konsantrasyonda olsa bile aflatoksin kontaminasyonu gösterebilecegidir.

Fiziksel-kimyasal yöntemlerin disinda çok çesitli firmalarin gelistirdikleri immunokimyasal test kitleriyle de aflatoksinleri ve diger önemli mikotoksinleri kalitatif ve kantitatif olarak saptamak olanaklidir. Mikrotitre-plaka test kitleri kompetetif ELISA esasina dayali olarak gelistirilmislerdir. Degisik firmalarca piyasaya sunulan bu kitler ile; AFB₁, AFM₁, toplam aflatoksin (B₁+B₂+G₁+G₂), OTA, zearalenon, T-2 toksin, deoksinivalenol ve fumonisin miktarlari belirlenir. Bu testlerde ortalama tekrar bulma orani % 70-90 arasindadir.Süt gibi sivi gidalarda örnek mikrotitre-plagina direk konurken kati örneklerde sadece metanol ekstraksiyonu yapilir. Hazirlik asamasindan sonra analiz süresi 1-3 saattir. Metodun avantaji ön islemlerin çok azaltilmis olmasi, islemin kisa sürmesi, 1  g.kg^-1 mikotoksin veya altindaki miktarlarin saptanabilmesidir.

Bu duyarliliktaki testlerle Avrupa ülkelerinde yasal veya öneri olarak benimsenmis sinir degerleri kontrol edilebilmektedir. Ayrica test sonuçlari fiziksel-kimyasal yöntemlerle saptanan degerlerle korelasyon gösterir. Yöntemin dezavantaji ise bazi hallerde yari kantitatif sonuçlarin alinmasidir. Ön islemlerdeki basitlestirme ile yeterince saflik saglanamadigindan gerek monoklonal gerekse poliklonal antikorlar, toksinle kimyasal yapi benzerligi olan bilesiklerle çapraz reaksiyona girerler. Böyle durumlarda metanol ekstraksiyonundan baska ayirma-saflastirma yöntemlerinin denenmesi çözüm olabilir.

ABD firmalarinca üretilen ve bu ülkede kullanilan hizli test yöntemleri ise daha az duyarli immunofiltrasyon esasli yöntemler olup Avrupa' da pek kabul görmemektedir.Bu testlerin analiz süresi sadece 10 dk. dir. Hizli testlerle yari kantitatif veya kalitatif sonuçlar alinabilmektedir. Avrupa mikotoksin sinir degerlerinin kontrolüne uygun duyarlilikta degildir. Bununla beraber çok çesitli tarim ürününün seri taranmasinda basariyla kullanilir.

08. Kaynakça

01. www.mikrobiyoloji.org

02.