Combinatorial thinking in chemistry and biology

Combinatorial Mutagenesis of hGH (Wells)
The second talk of this session provided a contrast to the
synthesis of small organic molecule libraries by illustrating the
combinatorial production and screening of several million
variants of the hGH protein. The purpose of this project is to
isolate a mutated version of hGH that can bind tightly to the
hormone’s receptor and block its signaling activity, thus acting
as a therapeutic agent for certain types of hypergrowth disor-
ders. A powerful method for isolating peptides or proteins with
improved or novel binding properties for a target receptor or
protein is called phage display (for reviews see refs. 11 and 12).
In this method, large numbers of mutated proteins or peptides
(exceeding 10
7
variants) were displayed on the surface of a
virus called M13 (Fig. 1B). Each virus in the library also
contains the gene that encodes protein variant linked to an
otherwise normal protein of the virus coat. By successive
rounds of affinity chromatography against the target receptor,
any virus that displays a fusion protein having improved
binding affinity to the hormone receptor can be sorted from
those that encode weaker binders (Fig. 1B). After several
rounds of sorting, viruses that display fusion proteins with
improved binding properties were cloned and their corre-
sponding genes sequenced to identify the fusion protein se-
quence.
Even with the ability to screen 10
7
variants the entire surface
of hGH could not be randomized, because greater than 20
185
variants would have to be screened for exhaustive analysis. To
limit the library to functionally important variants, high-
resolution mutational and structural studies of hGH were use
to identify regions of the hormone that are important for
binding (13). These studies indicate that there are two binding
sites on hGH (called Sites 1 and 2) that sequentially associate
with two receptors to form an active receptor complex. Ana-
logs of hGH that are potent antagonists have been produced
by mutating residues in Site 2 so that the hormone can only
form a 1:1 complex with the receptor, blocking association with
a second receptor molecule and therefore blocking signaling.
The Wells group reasoned that by improving the binding
affinity at Site 1 they could further improve these analogs as
antagonists.
Twenty of the residues in Site 1 were randomly mutated, in
groups of 4 residues at a time (5 separate libraries of viruses
displaying a total of 4
20
different hGH molecules each), so as
to search exhaustively for the best binding solution (13). From
each library, hormone mutants were isolated that were im-
proved by 2- to 8-fold in their binding affinities for the
extracellular domain of the hGH receptor. By simply combin-
ing these mutants, the affinity was further improved in a nearly
additive fashion by up to 400-fold. Virtually all of the enhanced
affinity was the result of a decrease in off-rate from the
receptor. Thus, hormone variants can be produced that bind
with higher affinity to their native receptors. When this mutant
was combined with one that cannot bind a second receptor, the
resultant was a much better antagonist of the hGH receptor.
This or similar antagonists may be useful in the treatment of
diseases involving hGH excess, such as acromegly.