Г. И. Али-заде, А. Р. Джалилова, Х. Х. Магеррамова, И. И. Алиев

Ekologiya və su təsərrüfatı  jurnalı, №4, sentyabr, 2016- cı il 

 

 

3 

EKOLOGĠYA VƏ ƏTRAF MÜHĠTĠN MÜHAFĠZƏSĠ 

 

УДК 581.1 

 

Г.И. АЛИ-ЗАДЕ, А.Р. ДЖАЛИЛОВА, Х.Х. МАГЕРРАМОВА, И.И. АЛИЕВ 

  

УСТОЙЧИВОСТЬ ФУНКЦИОНАЛЬНОЙ АКТИВНОСТИ КЛЕТОК  DUNALIELLA 

К ОСТРЫМ ДОЗАМ УФ-В ИЗЛУЧЕНИЯ, МОДИФИЦИРОВАННЫЕ  

СИНТЕТИЧЕСКИМИ АНТИОКСИДАНТАМИ 

 

Бакинский Государственный Университет 

[e-mail]

  

        

    В  работе  представлены  результаты 

изучения действия различных концентра-

ций  синтетических  антиоксидантов  2,6 

ди-трет-бутил  крезола  (ионол)  и  2,6  ди-

трет-бутил фенола на популяцию клеток 

Dunaliella salina IPPAS D-294.  

    Установлена биопродуктивность, ди-

намика  синтеза  суммы  каротиноидов, 

эндогенная активность каталазы и ПОЛ 

в  присутствии  различных  концентраций 

синтетических антиоксидантов в интен-

сивной культуре. 

      Показано,  что  модификация  клеток 

синтетическими антиоксидантами в те-

чение  24  часов  в  интенсивной  культуре, 

снижает  количество  синтезированных 

каротиноидов и процесс ПОЛ, повышает 

активность каталазы. 

      Выявлено,  что  популяция  водорослей 

Dunaliella,  модифицированные  синтети-

ческими антиоксидантами проявляет по-

вышенную функциональную устойчивость 

к  действию  последующих  различных    ос-

трых доз УФ-В излучения. 

  

Ключевые  слова:  зеленая  микроводо-

росль  Dunaliellа, синтетические  антиок-

сиданты, биопродуктивность, биосинтез 

суммы каротиноидов, каталазная актив-

ность,  процесс  ПОЛ,  функциональная 

устойчивость к УФ-В излучению  

      Введение.  В  живых  организмах  про-

текает  огромное  число  процессов  ради-

кального  окисления,  благодаря  которым 

осуществляется  значительная  часть  жиз-

ненно  важных  превращений,  включая 

синтез новых биологически активных со-

единений,  регулирование  биологических 

циклов  и  систем,  осуществление  функ-

циональной  деятельности  организмов. 

Количество необходимых для жизни сво-

бодных радикалов организмы регулируют 

с  помощью  системы  ферментов  антира-

дикальной защиты. С другой стороны, из-

быточное  накопление  свободных  радика-

лов,  нарушение  баланса  между  образую-

щимися  и  уничтоженными  радикалами 

приводит  к  развитию  окислительного  ст-

ресса,  который  сопровождается  повреж-

дениями биологических молекул, окисле-

нием  липидов,  модификациями  белков  и 

ДНК  [10-12].  Антиоксиданты  играют 

важную роль в регуляции протекания сво-

бодно-радикальных  превращений  в  орга-

низме,  способные  связывать  содержащие 

неспаренные  электроны  частицы  с  обра-

зованием менее активных или вовсе неак-

тивных радикалов, поэтому антиоксидан-

ты  и  исследование  антиокислительных 

свойств  соединений  в  последнее  время 

получили широкое распространение [5-7].  

       В последние годы  стало  активно раз-

виваться  новое  направление,  связываю-

щее  химию  и  биологию  антиоксидантов, 

обозначившее  важную  проблему-  зави-

симость  биологической  активности  анти-

оксидантов  от  их  свойств  как  ингибито-

ров  радикальных  реакций.  Целенаправ-

ленно  синтезировались  нетоксичные  ан-

тиоксиданты  разного  строения,  в  основ-

ном  производные  экранированных  фено-

лов [7, 8] пригодных в биологических ис-

следованиях,  гидроксипроизводные  гете-

роциклических  углеводородов  и  экрани-

рованных  фенолов  их  гомологических 

рядов  производных-антиоксидантов  [2]. 

Вместе с тем проведены исследования в  

Ekologiya və su təsərrüfatı  jurnalı, №4, sentyabr, 2016- cı il 

 

 

4 

моделях антирадикальной активности син-

тетических антиоксидантов с радикалами 

пептидов, возникающими при УФ – облу-

чении [1].  

        Очень мало сведений о действии син-

тетических  антиоксидантов  и  их  антира-

дикальными  свойствами  в  зеленых  мик-

роводорослях.  В  связи  с  этим  целью  на-

шей  работы  явилось  исследование  вли-

яния различных концентраций синтетиче-

ских  антиоксидантов  2,6  ди-трет-бутил 

крезола  (ионол-классический  синтетиче-

ский  антиоксидант)  и  2,6  ди-трет-бутил 

фенола  на  рост,  активность  эндогенной 

антиоксидантной системы водоросли  Du-

naliella    и  их  УФ-защитной  активности  в 

клетке. 

     Материалы  и  методы.  Объектом  ис-

следования служила галофильная зеленая 

микроводоросль  Dunaliella  salina  IPPAS 

D-294, выделенная из соленого озера Ма-

сазыр находящегося на северо-западе тер-

ритории города Баку. 

 

Водоросли  выращивали  при  темпера-

туре  27

о

С  в  стеклянных  фотореакторах 

(250  мл),  на  установке  для  выращивания 

культур  одноклеточных  водорослей.  Ис-

точником УФ-В излучения служила ртут-

ная  лампа  СВД-120,  снабженная  свето-

фильтром УФС-2. Минеральная среда со-

держала (г/л)



 NaCI – 87,5 (1,5 М); KNO

3

–

5,0; KH

2

PO

4

-1,25; MgSO

4

–50; FeSO

4

-0,009  

раствор микроэлементов (мг/л)–Ca(NO

3

)

2



 



H

2

O-735; H

3

BO

3 

- 735; ZnSO

4



7H

2

O - 615; 

(NH

4

)MoO

4

-100; MnCl

2



4H

2

O-180. Суспен-

зию клеток в фотореакторах в течение 24 

часов  освещали  белым  светом  (16  Вт/м

2

) 

и  непрерывно  продували  смесью  (воз-

дух+1,5%  СО

2

)  с  температурой  25

о

С. 

Клетки выращивали в течение 24 часов, в 

интенсивно-накопительном режиме куль-

тивирования  и  освещали  круглосуточно. 

Рост  культуры  определяли  периодичес-

ким  подсчетом  числа  клеток  в  камере 

Горяева под микроскопом или нефеломет-

рическим  измерением  оптической  плот-

ности  суспензии  на  фотоэлектроколо-

риметре.  

        Содержание  пигментов  в  клеточных 

экстрактах  (100%  ацетон)  измеряли  на 

спектрофотометре и рассчитывали на ос 

новании коэффициентов Веттштейна [3].            

       Для измерения фотосинтетической ак-

тивности  клеток,  выращенные  водоросли 

осаждали 

центрифугированием 

3000 

об/мин в течение 10 минут при комнатной 

температуре  и  переносили  на  свежепри-

готовленную  минеральную  среду.  Плот-

ность  суспензии  клеток  доводили  до 

10

6

кл/мл (оптическая плотность ОD=0,8). 

Скорость  выделения  кислорода  клетками 

измеряли  на полярографической  установ-

ке, с применением платинового электрода 

Кларка, освещая суспензию в термостати-

рованном  объеме,  белым  светом  насы-

щающей интенсивности (100 Вт/м

2

).      

      Для измерения каталазной активности 

клеток, суспензию осаждали центрифуги-

рованием (3000 об/мин.). Осадок перено-

сили  в  ступку  с  0,5г  СаСО

3

,  добавляли  5 

мл  дистиллированной  воды  и  растирали 

до однородной массы.  После этого полу-

ченную массу количественно переносили 

в  стакан  емкостью  50  мл  до  метки  и  на-

стаивали  при  периодическом  взбалтыва-

нии  3-4  часа.  В  течение  этого  времени 

идет  экстракция  фермента  из  раститель-

ного  материала.  После  настаивания  сус-

пензию фильтровали в сухой стакан. Ак-

тивность  каталазы  измеряли  газометри-

ческим методом, который основан на оп-

ределении  объема  после  прибавления  к 

водному  экстракту  из  растений,  содер-

жащему каталазу, перекиси водорода [4]. 

Оценка  степени  перекисного  окисле-

ния  липидов  (ПОЛ)  была  проведена  по 

методу  определения  содержание  МДА  в 

клетках Dunaliella salina – методом, осно-

ванным  на  реакции  с  тиобарбитуровой 

кислотой. Суспензию клеток (35 мл) цен-

трифугировали  при  3000  об/мин  в  тече-

ние  10  минут.  Полученный  осадок  гомо-

генизировали  в 20 мл 0,1%-ой  ТХУ. Го-

могенат  центрифугировали  при  3000 

об/мин в течение 10 минут. К 1мл супер-

натанта добавляли 4 мл 20% ТХУ, содер-

жащую 0,5% ТБК. Смесь нагревали  в во-

дяной бане при 95

0

С в течение 30 мин. И 

сразу  охлаждали  под  проточной  водой. 

После  центрифугирования  смеси  при 

3000 об/мин в течение 10 минут, опреде-

ляли  оптическую плотность супернатан- 

Ekologiya və su təsərrüfatı  jurnalı, №4, sentyabr, 2016- cı il 

 

 

5 

та при 532 нм [9]. 

Результаты и обсуждение. Известно, 

что при характеристике штамма однокле-

точных  водорослей  получаемые  зависи-

мости существенно меняются от  условий 

культивирования. При этом существенное 

значение  имеет  оптимизация  роста,  на-

копления биомассы и фотосинтетической 

продуктивности  культур  микроводорос-

лей  для  полного  выявления  их  высокой 

потенциальной  биосинтетической  актив-

ности. На основании проведенных иссле-

дований  с  водорослью  Dunaliella  salina 

IPPAS D-294 получены оптимальные зна-

чения  температуры,  интенсивности  света, 

содержание  СО

2

  в  воздушной  смеси,  со-

держание  NaCI  в  минеральной  среде.   

При оптимальных условиях (температура 

27

0

С,  интенсивность  света  16  Вт/м

2

,  со-

держание  СО

2

  в  воздушной  смеси  1,5%, 

минеральная  среда  содержащая  1,5  М 

NaCI)  выращивание  клеток  в  250  мл 

стеклянных  фотореакторах  и  подаче  воз-

душной смеси с температурой 25

0

С в  ин-

тенсивно–накопительном  режиме  куль-

тивирования в течение 24 часов показали, 

что оптическая плотность клеточной сус-

пензии увеличивается в 3,5-4 раза.  Такая 

тенденция роста популяции продолжается 

и  в  последующих  повторных  вариантах 

выращивания контрольных суспензий. 

        В  любом  живом  организме  каждое 

мгновение протекает огромное число про-

цессов радикального окисления, благода-

ря которым осуществляется значительная 

часть  жизненно  важных  превращений, 

включая  синтез  новых  биологически  ак-

тивных  соединений,  трансформацию  ве-

ществ в сериях каскадных реакций, регу-

лирование  биологических  циклов  и  сис-

тем, осуществление функциональной дея-

тельности  органов  и  т.д.  Количество  не-

обходимых  для  жизни  свободных  ради-

калов организмы регулируют с помощью 

системы  ферментов  антирадикальной  за-

щиты.  Существенно  уменьшить  окисли-

тельный стресс и его последствия можно 

с  помощью  экзогенных  синтетических 

антиоксидантов,  среди  которых  важней-

шее  место  отводится  пространственно  за-

трудненным фенолам, в  

частности ионолу и его производным.   

       На  рисунке  1  представлена  зависи-

мость роста популяции  клеток Dunaliella 

salina IPPAS D-294 от различных концен-

траций 2,6 ди-трет-бутил крезола (ионо-

ла)  (1)  и  2,6  ди-трет-бутил  фенола  (2)  в 

минеральной  среде.  Как  видно  из  рисун-

ка,  присутствие  ионола  и  2,6  ди-трет-

бутил фенола в среде выращивание заме-

тно  влияет  на  рост  культуры.  Так,  при 

концентрациях 25 мкМ и 50 мкМ в мине-

ральной  среде    ионола  дифференцировка 

клеток увеличивается на 2,5 % и 4,5% со-

ответственно,  а  в  присутствии  2,6  ди-

трет-бутил фенола 3% и 5% по отноше-

нию  с  контрольным  суспензиям.  Значит, 

ионол  и  2,6  ди-трет-бутил  фенол  при 

низких концентрациях 25 мкМ и 50 мкМ 

сопоставимы с активностью обычных фи-

тогормонов.  При  концентрациях  150-350 

мкМ  в минеральной среде ростостимули-

рующее  действие  ионола  и  2,6  ди-трет- 

бутил фенола заметно уменьшается.  При  

повышении  содержания  ионола и  2,6  ди-

трет-бутил фенола в минеральной среде 

примерно на порядок (500 мкМ) оно при-

обретает обратный знак, наблюдается по-

давление  (15%)  и  (10%)  соответственно 

роста  культуры  в  течение  24  часового 

культивирования  в  интенсивно-накопи-

тельном  режиме.  Выраженная  ростости-

мулирующая активность ионола и 2,6 ди-

трет-бутил  фенола  при  его  низких  кон-

центрациях  в  минеральной  среде  делает 

эти антиоксиданты перспективными и эф-

фективными  средствами  доступной  и на-

дежной  регуляции  (активации)  роста 

культуры клеток  Dunaliella salina IPPAS 

D-294.   

       Для  выяснения  функциональной  ак-

тивности    Dunaliella  salina  IPPAS  D-294 

при  модификации  водорослей  в  течение 

24  часов  с  различными  концентрациями 

синтетических  антиоксидантов  ионола  и 

2,6 ди-трет-бутил фенола в минеральной 

среде  показали,  что  синтетические  анти-

оксиданты  ионол  и  2,6  ди-трет-бутил 

фенол в исследованном диапазоне подав-

ляют    фотосинтетическое  выделение  ки-

слорода суспензией клеток.  

Ekologiya və su təsərrüfatı  jurnalı, №4, sentyabr, 2016- cı il 

 

 

6 

 

Рис.1. Зависимость роста популяции клеток  

Dunaliella salina IPPAS D-294 от различных 

концентраций  2,6 ди-трет-бутил крезола (1) 

и 2,6 ди-трет-бутил фенола (2) в минераль-

ной среде. 

 

Температура  27

0

С,  интенсивность  света 

16 Вт/м

2

. 

На  рисунке  2  представлены  данные  

фотосинтетического  выделения  кислоро-

да  клетками  Dunaliella  salina  IPPAS  D-

294,  выращенными  при  различных  кон-

центрациях  2,6  ди-трет-бутил  крезола 

(1) и 2,6 ди-трет-бутил фенола (2) в ми-

неральной  среде.  Как  видно  из  рисунка, 

фотосинтетическое  выделение  кислорода 

клетками  Dunaliella  salina  IPPAS  D-294, 

при  модификации  (выращивание  в  тече-

ние 24 часов в интенсивном режиме куль-

тивирования)  различными  концентрация-

ми ионола (25-500 мкМ) несмотря на рос-

товую  стимуляцию  при  малых  концен-

трациях 25мкМ и 50 мкМ (рис.2 кривая 1) 

значительно  подавляется  уже  при  кон-

центрации  25мкМ  (20%).  Модификация 

клеток  ионолом  высокой  концентрации 

50-150  мкМ  подавляет  функцию  клеток 

на 30-32%, а при 350-500 мкМ до 35-37%. 

 

 

Рис. 2. Фотосинтетическое выделение ки-

слорода   клетками  Dunaliellasalina IPPAS 

D-294,   выращенными при различных кон-

центрациях крезола(1) и 2,6 ди-трет-бутил 

фенола (2) в минеральной среде. 

Температура 40

0

С, интенсивность све-

та 100 Вт/м

2 

    Выявленное  нами регулирующее рост 

и  развитие  водорослей  действие  ионола 

по  сравнению  с  действием  2,6  ди-трет-

бутил фенола, который по структуре иден-

тичен  ионолу,  однако  лишен  метильной 

группы  оказался  также  эффективным  ан-

тиоксидантом,  физиологически  актив-

ным.  Это  соединение  обладает  аналогич-

ным  ионолу  действием:  выращенные  в 

присутствии  25мкМ  и  50  мкМ  2,6  ди-

трет-бутил фенола при оптимальных ус-

ловиях  наблюдается  стимуляция  роста 

водорослей  при  интенсивном  культиви-

ровании (рис.1, кривая 1). Начиная с кон-

центраций 150 мкМ и выше, наблюдается 

подавление  биопродуктивности  клеток 

при  24  часовом  культивировании.  Таким 

образом,  в  присутствии  2,6  ди-трет-бу-

тил  фенола  в  минеральной  среде  с  раз-

личными  концентрациями  по  показател-

ям  роста  он  действует  как  антиоксидант, 

аналогично  ионолу.  Не  исключено,  что 

синтетический антиоксидант 2,6 ди-трет-

бутил  крезол  (ионол)  и  новый  2,6  ди-

трет-бутил фенол имитируют и даже вы-

полняют  роль  росторегулирующего  аген-

та. 

 На рисунке 2 (кривая 2) представлены 

результаты  фотосинтетического  выделе-

ния кислорода клетками  Dunaliella  salina 

IPPAS  D-294,  выращенными  при  различ-

ных  концентрациях  2,6  ди-трет-бутил 

фенола  в  минеральной  среде.  Как  видно 

из  рисунка  концентрации  2,6  ди-трет-

бутил  фенола  (25-500  мкМ)  приводят  к 

подавлению  функциональной  активности 

клеток  Dunaliella.  В  данном  случае  на-

блюдаемое  подавление  функции    2,6  ди-

трет-бутил  фенолом  значительно  отли-

чаются от антиоксиданта ионола, так при 

концентрациях  25мкМ  и  50  мкМ  подав-

ление  функциональной  активности  кле-

ток  незначительно  2%  и  5%  соответст-

венно. Увеличение концентрации 150 мкМ 

и  выше приводит к резкому подавлению 

28%  и  48%  (350  и  500  мкМ)  фотосинте-

тического выделения кислорода клетками, 

что  не  наблюдали  в  исследованиях  с  ио-

нолом. Несмотря на то, что растительные 

клетки  обычно  обладают  высоким  уров-

нем антиокислительной активности и, как 

Ekologiya və su təsərrüfatı  jurnalı, №4, sentyabr, 2016- cı il 

 

 

7 

правило,  содержат  большое  количество 

антиоксидантов  различной  химической 

природы, нам хотелось исследовать, в ка-

кой  степени,  использованные  синтетиче-

ские  антиоксиданты  в  среде  выращива-

ния  в  течение  24  часов  культивирования 

могут  повлиять  на  активность  эндоген-

ных низкомолекулярных (каротиноиды) и 

высокомолекулярных  (каталаза)  антиок-

сидантов, а также на процесс перекисного 

окисления липидов. 

       В  таблице  1  представлены  показате-

ли роста, пигментообразования, каталаз-

ной активности и количества образован-

ного МДА в клетках Dunaliella в контро-

ле и при обработке клеток антиоксидан-

том 2,6 ди-трет-бутил крезолом (ионол) 

с  различными  концентрациями    в  тече-

ние  24  часового  культивирования.  Как 

видно из таблицы,  модификация суспен-

зии  клеток  ионолом  при  концентрациях 

25  мкМ  и  50  мкМ  приводит  к  повыше-

нию активности эндогенной каталазы  на 

60%.  Повышение  концентрации  ионола 

150-500  мкМ  несколько  снижает  ката-

лазную активность 58%, но она остается 

высокой  по  отношению  к  контрольным 

клеткам.  Модификация  ионолом  суспен-

зии  клеток  приводит  к  резкому  сниже-

нию  биосинтеза  каротиноидов,  так    при 

концентрации  25  мкМ  82%;  50  мкМ 

62%;  150мкМ  69%;  250  мкМ  66%;  350 

мкМ 50%; 500 мкМ 45%.  Наряду с каро-

тиноидами  подавляется  синтез  хлоро-

филлов «а» и «б». Проведена также оцен-

ка  интенсивности  процессов  перекисно-

го окисления липидов (ПОЛ) в условиях 

модификации  клеток  синтетическим  ан-

тиоксидантом  ионолом  на  стадии  разви-

тия  водоросли  в  интенсивно-накопи-

тельном  режиме  культивирования.  Пока-

затели  интенсивности  процессов  пере-

кисного  окисления  липидов  клеток,  оп-

ределяемые  по  содержанию  МДА,  при 

малых концентрациях 25 мкМ  и 50 мкМ 

оставались  выше  уровня  контроля,  а  по 

мере  увеличения концентрации синтети-

ческого антиоксиданта снижалось до ми-

нимального уровня 33% при 500 мкМ.  

Таблица 1 

Показатели роста, пигментообразования, каталазной активности и количества образо-

ванного МДА в клетках Dunaliella в контроле и при обработке клеток антиоксидантом 

2,6 ди-трет-бутил крезолом 

 

 

 

Рост, ОD 

Каталазная актиность, 

мкМ Н

2

О

2

 мл

-1

 мин

-1

. 

Количество пигментов, мг/л. 

Содержание 

МДА, моль/г 

сырого веса 

5 

10 

15 

20 

Ca 

Сb 

Скар. 

К 

0,3 

1,20 

0,4 

0,9 

1,1 

1,2 

3,46±0,05 

1,73±0,05 

1,34±0,1 

1,9*10

-3

±0,05 

О

1 

0.3 

1,23 

0,6 

1,2 

1,7 

2,0 

3,0±0,05 

1,5±0,05 

1,1±0,1 

1,26*10

-3

±0,05