İsim Okul Numarası

08.03. Ziehl Neelsen Boyama Yöntemi

Aynı Mycobacterileri boyamada olduğu gibi hazırlanır, kullanılır ve değerlendirilir.

08.04.  Giemsa Boyama Yöntemi

Bu yöntemle H. capsulatum iyi bir şekilde görülür.

Solüsyonlar

1- Stok solusyonu

Giemsa tozu                600 .0 mg.

Metil alkol (asetonsuz)   50.0  ml.

Gliserin (nötral)              50.0  ml.

Giemsa tozu bir havana konur ve az bir gliserin içinde ezilerek eritilir. Bir silindire alınır ve üst 1/3 kısmı temiz bir şişeye konur. Geride kalan kısma gliserin konarak ezilir ve aynı şişeye aktarılır. Şişenin ağzı kapatılır ve 55oC'de 2 saat tutulur. Her yarım saatte bir hafifçe çalkalanır. Bu sürenin sonunda karışım soğutulur. Havanda kalan boya alkolle toplandıktan sonra tekrar aynı şişeye aktarılır. Kullanılmadan önce iki hafta bekletilir. Damlalıklı şişe içinde kullanılır.

2- Buffer solusyonu (pH 7.2)

Na2HPO4 (susuz)               6.77 g.

KH2PO4                            2.59 g

Distile su                            1000 .0 ml.

3- Boyama solusyonu

Stok boya solusyonu    2.0 ml.

Buffer sol.                     6.0 ml.

Bunlar birbirine katılarak iyice karıştırılırlar.

Boyama yöntemi

1- Preparat hazırlanır, kurutulur ve metil alkolde (% 100) 3-5 dakika fikze edilir.

2-  Boya solüsyonunda 15 dakika boyanır.

3-  Hafif akan suda yıkanır.

4- Kurutulur (havada).

5- lmmersiyonla muayene edilir.

08.05. Periodik Asit Schiff ( PAS ) ile Boyama

Patojenik mantarları özellikle, C. neoformans, H. capsulatum, B. dermatitidis, C. albicans v.s.gibi mantarlar ile deri ve tırnak kazıntılarını muayenede kullanılır.

Doku seksiyonları da aynı yöntemle boyanarak muayene edilirler.

A- Deri kazıntıları için: Temiz bir lâmın üzeri Mayer albumini ile kaplandıktan sonra deri kazıntıları konur ve iyice bastırılır, alttan hafifçe ısıtılır ve kazıntıların lâma yapıştığına dikkat edilir.

1-Alkol (% 95) içine bir dakika daldırılır.

2- Periodik asit (%5) içine de beş dakika bırakılır.

3-  Aşağıdaki solüsyona 2 dakika bırakılır.

Bazik fuksin                       0.1 g.

Alkol (% 95)                      5.0 ml.

Distile su               95.0 ml.

4- Preparat hafif akan suda yıkanır.

5- Aşağıdaki solüsyona 10 dakika süre ile daldırılır.

Zink(veya sodium)hidrosulfit.          1.0 g.

Tartarik asit                                    0.5 g.

Distile su                            1000.0 ml.

6- Preparat hafif akan suda yıkanır.

7- Aşağıdaki boyalardan biri ile boyanır. Ya satire pikrik asit ile 2 dakika veya light green ile 5 saniye boyanır.

Light green             1.0   g.

Glacial acetic asit   0.25 ml.

Alkol (% 80)         100.0 ml.

8- Suda hafifçe yıkanır.

9- Alkol de ( %95 ) 10 saniye ve % 100 alkolde 1 dakika tutulur. Sonra ksilol içinde 2 defa (her biri birer dakikalık) yıkanır. Kurutulduktan sonra üzerine polivinil alkol-kloral hidratlı solüsyon konur ve lâmelle kapatılarak mikroskopta muayene edilir.

Mantar parlak kırmızı veya mavi-kırmızı renkte görülür.

B- Doku seksiyonları için: Dokular fikse edildikten, kurutulduktan ve parafin içine yatırıldıktan ve kesildikten sonra rutin yöntemle boyanır.

1-  Kesit, ksilol içine konarak deparafinize edilir.

2- Alkolde ( % 100 ) yıkanır.

3- Distile suda yıkanır.

4-  Periodik asit (% 1 ) içinde 10 dakika tutulur.

5- Su içinde 5-10 dakika tutulur.

6-  Aşağıdaki solüsyonda 2 dakika tutulur.

Bazik fuksin           0.1 g.

Alkol ( %95 )          5.0 ml.

Distile su              95.0 ml.

7- Suda 10 saniye yıkanır.

8- Zink hidrosulfit solüsyonunda 2-3 saat tutulur.

9- Suda 3-5 dakika yıkanır.

10-  Light green solüsyonunda 2 dakika boyanır.

11- Suda kısa bir süre yıkanır.

12- Alkolde ( %95 ) 10 saniye ve %100 alkolde bir dakika tutulur. Sonra ksilol içinde 2 defa (her biri birer dakikalık) yıkanır.

Kuruduktan sonra üzerine polivinil alkol kloralhidrat solusyonu konarak lâmelle kapatılır. Mikroskop altında muayene edilir.

08.06. Gridley Boyama Yöntemi

Doku kesitlerinde mantar elementlerini (spor, hifa, v.s.) görmede ve incelemede kullanılır.

Bu muayenede uygun bir fiksatifle iyice tespit edilmiş 6 mikrometre kalınlığında parafin seksiyonları kullanılır.

Aşağıdaki tarzda hareket edilir.

1- Kesitler ksilol, absolut alkol ve % 95 alkolle deparafinize edilir.

2- Kromik asit (%4) içinde 1 saat bekletilir. (Okside).

3- Akan suda 5 dakika yıkanır.

4- Colemen feulgen reagentinde 15 dakika bekletilir.

5- Sulfuroz asitte 3 dakika yıkanır (her biri 2 dakika)

6- Akan suda 15 dakika yıkanır.

7- Preparat aldehit-fuksin solusyonuna 15-30 dakika süre ile konur.

8- Alkolle (%95) yıkanır. Fazla boya atılır.

9- Suda yıkanır.

10-  Metanil yellow boyası ile 2-5 dakika boyanır.

11- Suda yıkanır.

12- Alkol ( %95 ) ve absolut alkolde dehidre edilir.

13- Ksilolde berraklaştırılır.

14- Permounta yatırılır.

Sonuç: Miselyum, koyu mavi konidiumlar koyu kırmızı ve purpul, zemin sarı, elastik doku ve musin ise mavi boyanır.

Bu boyama yönteminde kullanılan bazı solüsyonlar:

Kromik asit solusyonu (taze)

Kromik asit 4.0 gr.

Distile su 100.0 ml.

Coleman Feulgen reagenti

Bazik fuksin 1.0 gr.

Distile su 100.0  ml.

Bazik fuksin sıcak distile suda eritilir, soğutulur ve filtre edilir. Filtrata 2 g. sodyum metabisulfit ve 10 ml. normal HCI ilave edilir. Karışım 2. saat bekletildikten sonra 0.5 g. aktif karbon katılır ve bir dakika çalkalanır, sonra, kaba kağıttan süzülür. Filtrat renksiz olmalıdır. Buz dolabında saklanır.

Normal HCI solusyonu

HCI (1.19)      83.5   ml.

Distile su        916.5 ml.

Sodyum metabisulfit solusyonu

Sodyum metabisulfit     10.0  g.

Distile su                      100.0 ml.

Sulfuroz solusyonu

Sodyum metabisulfit (% 10) 6.0 ml.

Normal HCI              5.0 ml.

Distile su              100.0 ml.

Aldehit-fuchsin solusyonu

Bazik fuchsin       1.0 g.

Alkol (%10)      200.0 ml.

Paraaldehid         2.0 ml.

HCI (yoğun)         2.0 ml.

Bu solüsyon oda ısısında saklanır. Kullanmadan önce filtre edilir.

Metanil yellow solusyonu

Metanil yellow        0.25  g.

Distile su              100.0  ml.

Glacial asetik asit   0.25 ml.

Mucicarmin boyası

Carmine                           1.0  g.

Alüminyum klorid (susuz) 0.5  g.

Distile su                          2.0 ml.

Materyal küçük bir tüpte karıştırılır. Alevde 2 dakika ısıtılır. Sıvı, siyah ve şurup gibi bir görünüm alır. Alkol (% 50) 100 ml. katılarak dilue edilir ve 24 saat bekletilir. Filtre edilir ve 1/4 oranında su ile sulandırılarak kullanılır.

08.07. Akridin Oranj Boyası

Bu boya, preparatlarda, doku kesitlerinde ve taze materyallerdeki mantar elementlerini ortaya koymada yararlı olur. Bu boya ile aşağıdaki tarzda boyama yapılır.

Kıl ve deri kazıntılarını muayene

1-  %20 KOH solüsyonundan hazırlanır.

2- %0.1 akridin oranj solüsyonundan 1 ml. alınarak 9 ml. KOH ( %20 ) katılır.

3-Temiz bir lâm üzerine 2 damla acridin oranj solusyonu ve bunun üzerine de kıl,deri ve tırnak kazıntıları konulur. İyice karıştırılır.

4- Üzeri lâmelle kapatılır.

5- Preparat çok hafifçe ısıtılır.

6- Özel mikroskopta muayene edilir.

Doku kesitlerini muayene

1- Parafinli ince kesitler ksilol ve alkol solüsyonlarından geçirildikten sonra distile su ile yıkanır.

2- Weigert demir hematoxylen ile 5 dakika boyanır.

3- Akan suda 3-5 dakika yıkanır.

4.- Acridin oranj (% 0.1) ile 2 dakika boyanır.

5- Akan suda 30 saniye yıkanır.

6- Alkol (% 95) içinde bir dakika dehidre edilir.

7-  Absolut alkolde 2-3 kez dehidre edilir.

8- Ksilolde berraklaştırılır.

9- Üzerine fluoresans vermeyen bir medium konarak lâmel kapatılır.

10- Özel mikroskopla muayene edilir.

09. Antifungal İlaçlar (Antifungal Kemoterapötikler)

Mantar infeksiyonlarında proflaksi ve sağaltım, bakteri hastalıklarından daha az başarılı olduğu gibi daha fazla da zaman alır. Bakterileri etkileyen ilaçların çoğu mantar infeksiyonlarında kullanılamazlar. Çünkü, bakteriler prokaryotik olup, yapıları ökaryotik olan mantarlardan farklıdır. Bakterilerin etrafında peptidoglikan, lipopolisakkarid, protein kompleksleri bulunmasına karşın, mantar hücre duvarlarında kitin, selüloz ve diğer polisakkarid bileşikleri vardır.

Mantarlar, insan ve hayvanlarda, iki karakterde hastalık oluştururlar. Bunlardan biri mantar toksinlerinin (mikotoksin) oluşturduğu mikotoksikozisler ve diğeri de mantarların bizzat kendilerinin meydana getirdiği infeksiyonlardır (mikozes). Antifungal ilaçlar, mikotoksikozislerde kullanılamazlar. Ancak, mikozes olgularında, mantar hücreleri üzerine olumsuz etkide bulunurlar. Mantarlar aynı zamanda ilaçları modifiye ve inaktive edecek mekanizmalara da sahiptirler.

Antifungal substansların bazıları, çeşitli mantarlardan fermentasyon suretiyle elde edilirler. Pratikte bulunan antimikotik ilaçların hemen hepsi de yüzeysel ve sistemik mantar infeksiyonlarında kullanılırlar. Mikotoksikozislerde ise yararlanılamazlar.

Yüzeysel mantar infeksiyonlarının teşhisi kolay, buna karşın tedavisi zor ve zaman alıcıdır. Bazen de tam bir sağaltım gerçekleştirilemez. Sistemik infeksiyonları teşhis ve tedavi oldukça güçtür. Bazen de imkansızdır.

Antimikotik ilaçların çoğu daha ziyade, Chitin senthase  ve sterol sentezine etkilerler. Hücre duvarı yapısının kimyasal bileşimini bozarlar. Membranda delikler açar, permeabiliteyi bozar ve sterol sentezini inhibe ederler.

Mikozislerde kullanılan antifungal ilaçlardan başlıcaları aşağıda bildirilmiştir.

Amphotericin B: Bu ilaç Streptomyces nodosus 'tan elde edilir. Mantar hücre duvarındaki sterole bağlanarak hücre permeabilitesini bozar. Sistemik mikozeslerde kullanılır. Yan etkileri vardır.

5- Flucytosine : 5- Fluorocytosine, sentetik antimikotik bir preparat olup, sistemik mantar infeksiyonlarında kullanılır. İlaç, mantar hücre RNA'sı ile birleşerek fonksiyonlarını bozar. İlaca karşı dirençlilik oluşabilir. Yan etkileri vardır.

Fluconazole, Clotrimazole ve Tereonazole : Aynı amaçlarla kullanılan antimikotik preparatlardır.

Griseofulvin : Penicillium griseofulvinden elde edilen antifungal bir substanstır. Dermatofitlerden ileri gelen süperfisial mikozislerde kullanılır. İlaç nukleik asite etkileyerek hücre bölünmesine mani olur.

Dermatofitlerin ve sistemik mikozeslerin sağaltımında geniş spekturuma sahip olan imidozollu antifungal ilaçlar tercihen kullanılmaktadır. Bunlar sitoplasmik membrandaki sterollerin sentezini bozarak permeabiliteye olumsuz yönde etkilerler.

Ketoconazole : Kronik Candidiasis, dermatofitosiz ve sistemik mikozeslerde kullanılan bir ilaçtır. Yan etkileri vardır.

Miconazole : Bu ilaç Candidiasis ve sistemik mantar infeksiyonlarında kullanılır. Deride krem veya losyon tarzındaki preparatlardan yararlanır. Sistemik infeksiyonlarda parenteral kullanıldığında yan etkileri olabilir.

Nystatin (C46 H75 NO18 ) : Streptomyceslerden elde edilen polyene bir antibiyotiktir. İlaç, özellikle, Candidaların hücre duvarındaki sterollere bağlanarak permeabiliteyi bozar. Nystatin, Candida infeksiyonlarının kontrolünde yararlanılır.

Tolnaftate : Kutan mantar infeksiyonlarında yararlanılan bir ilaçtır.

Bazı antifungal kemoterapötiklerin kullanıldığı infeksiyonlar ve yan etkileri aşağıdaki tabloda gösterilmiştir.

























Kaynakça

BİLGEHAN, H. Temel Mikrobiyoloji ve Bağışıklık Bilimi, Barış Yayınları Fakülteler Kitabevi,

İzmir, 1989.
ÇETİN, E.T. , Ö. Anğ., Töreci, K. Tıbbi Parazitoloji, İstanbul Üniversitesi Tıp Fakültesi

Yayın No: 15, Fatih Gençlik Vakfı Matbaası, İstanbul, 1985.

HOWARD, B.J., Klaas II J., Rubin, S.J., Weissfeld A.S., Tilton, R.C., Clinical and Pathogenic

Microbiology, The C.V. Mosby Company, St., Louis, Washington, D.C., Toronto,

1987.
JAWETZ, E., (Ed). Medical Microbiology, Appleton and Lange, Norwalk, Connecticut /

Los Altos, California, 1989.

MURRAY, P.R., Drew, W.L., Kobayashi G.S., Thompson, W.H., Medical Microbiology,

Wolfe Medical Publ. Print. USA, 1990.
UNAT, E.K., Temel Mikrobiyoloji, Beta Basım Yayım A.Ş., İstanbul, 1985.