Masarykova univerzita v Brně Lékařská fakulta

3.3Příprava materiálu

Pro vyšetření generace trombinu byla použita citrátová bezdestičková plazma. Venózní krev byla odebrána do plastové zkumavky obsahující jako protisrážlivé činidlo 0,109 mol/l citrát sodný. Následně bylo nutné, nejpozději do hodiny od odběru, citrátovou krev zcentrifugovat, 10 minut při 2000 g při pokojové teplotě. Po centrifugaci se stočená plazma odebrala do zkumavky Eppendorf a ihned zpracovala. Pokud nebylo možné vzorek ihned vyšetřit, byla plazma šokově zmražena při -196°C v tekutém dusíku a byla uchována nejdéle 1 měsíc při -80°C. Před následným vyšetřením byla zmražená plazma vytemperována v termostatu na 37°C a takto byla připravena k použití.

3.4Reagencie a přístroj

TGA byl měřen na fluorescenčním readeru Fluoroskan Ascent^® (Thermo Fisher Scientific Inc., USA) s dispenzorem (Obr. č. 8), použitý software Thrombinoscope™ Software (version 3. 0. 0. 29) a reagenciemi od firmy Thombinoscope BV, Netherlands.

Obr. č. 8: Fluoroskan Ascent

Pro měření byly použity tyto reagencie:

PPP–Reagent 5 pM: Užívá se jako spouštěč zahájení generace trombinu, byl přidávaný do plazmy chudé na destičky (PPP). Obsahuje směs fosfolipidů a tkáňového faktoru. Po přidání 20 l FluCa k plazmě obsahovala reakční směs 5 pM tkáňového faktoru a 4 M fosfolipidu.
Thrombin Calibrator – musí být použit u každého měření (u každého pacienta). Výrobce dodává aktuální hodnotu enzymové aktivity pro danou šarži kalibrátoru. Tato aktivita byla vždy následně zadána do měřícího softwaru fluorescenčního analyzátoru.
FluCa–Kit: Fluo–pufr – společně s vhodným množstvím Fluo–substrátu se nazývá FluCa a byl používán u každého měření a v každé jamce. Tato směs byla automaticky dávkována přístrojem do citrátové plazmy a tím docházelo k nastartování reakce. Fluo-pufr obsahuje Hepes (pH 7,35) a chlorid vápenatý. Pufr byl před smícháním s Fluo-substrátem zahřátý na 37°C. [26]
Aqua pro inj. (Ardeapharma, ČR): slouží pro rozpuštění lyofilizovaných reagencíí a také jako promývací roztok pro Fluroscan Ascent^®.

Přístrojové vybavení:

• 
  Vodní lázeň
  
• 
  Centrifuga
  
• 
  Fluoroskan Ascent^® - Fluoroskan Ascent^® je kompaktní kombinovaný reader určený pro fluorometrická a luminometrická stanovení na mikrodestičkách (96 – 384 – jamkových destičkách). Fluorometrický rozsah vlnové délky v rozsahu (320 – 700 nm) je vybírán z maximálně osmi excitačních a osmi emisních interferenčních filtrů. Výhody optického systému jsou založeny na přímé iluminační optice, umožňující preventivní crosstalk a velkou přesnost čtení. Výběr dvou paprsků umožňuje nastavení optimálního čtení pro 1 až 96, 384 jamek. Možnost integrovaných dávkovačů umožňuje velmi přesné dávkování v několika pozicích podle výběru. Zdroj excitačního světla a detektor emisního světla je umístěn na té samé straně jako mikrodestička. Filtry se nachází ve dvou filtrových kolech. Přístroj má možnost horního i spodního čtení (Obr. č. 9). [25]
  

Obr. č. 9: Průnik paprsku vzorkem

3.5Měření

Během měření bylo potřeba dodržovat přesný postup, díky němuž se docílí přesných a správných výsledků.

Do předem vytemperované ELISA destičky bylo pipetováno dle pipetovacího schématu: 20 l PPP reagentu či trombinového kalibrátoru a 80 l předem připravené plazmy pacienta (vše měřeno v tripletu, takže pro vyšetření jednoho pacienta byly použity 3 jamky ELISA destičky pro pacientovu plazmu a 3 jamky pro trombinový kalibrátor). Obr. č. 10

Obr. č. 10: Pipetovací schéma. Červené jamky jsou určeny pro PPP reagent, žluté pro trombinový kalibrátor.

Měřící destička spolu s napipetovanou plazmou a reagenciemi byla vložena do fluorometru Fluoroskan Ascent^®, který byl vytemperován na 37°C. Ve fluorometru byl připraven roztok FluCa (příprava podle počtu použitých jamek ELISA destičky, viz tabulka č. 2), přičemž jeho automatickým přidáním do jamek s plazmou se startovala analýza.

Měření probíhalo při vlnových délkách 390/460 nm (excitace/emise), snímání fluorescence v intervalu 20 s, automatické míchání v intervalu 10 s.

Počet jamek	Celkový objem FluCa	Objem pufru	Objem substrátu
48 a méně	1640l	1600l	40l
58	1845l	1800 l	45l
68	2050l	2000 l	50l
78	2255l	2200 l	55l
88	2460l	2400 l	60l
Celá destička (96)	2665l	2600 l	65l

Tabulka č. 2: Příprava množství FluCa roztoku
Analýza probíhala podle nastavení přístroje 45 – 60 minut a její průběh bylo možné sledovat na monitoru přídavného počítače. (Obr. č. 11)



Obr. č. 11: Průběh měření
Výstupem testu je trombinogram, již zmíněný v kapitole 3. 1. 3. Princip použité metody. Na obrázku č. 12 je ukázka výsledné křivky u warfarinizovaného pacienta vs. křivka zdravého pacienta.

Obr. č. 12: Porovnání 2 výsledných trombinogramů: červená křivka = warfarinizovaný pacient, modrá křivka = zdravý pacient.