Masarykova univerzita v Brně Lékařská fakulta

2.3Funkce trombinu v systému

Trombin je často považován za konečný produkt koagulační kaskády a právě proto je odpovědný za konečný krok – konverze rozpustného proteinu fibrinogenu na nerozpustnou fibrinovou zátku. Nicméně koagulační kaskáda má mnoho zpětnovazebných smyček a inhibičních cest, které jsou přímo nebo nepřímo ovlivňovány vznikajícím trombinem, tudíž trombin hraje centrální a klíčovou roli celým procesem koagulace. Ve svých mnoha funkcích trombin působí jak prokoagulačně, tak antikoagulačně. Vedle štěpení fibrinogenu na fibrin aktivuje limitovanou proteolýzou kofaktory FV a FVIII (pozitivní zpětná vazba), při větším množství naopak trombin tyto faktory degraduje. Dále aktivuje FXIII, je schopen aktivace i FIX, je mohutný induktor aktivace trombocytů. Na endotelu posiluje tvorbu a sekreci tPA a dalších látek. Po vazbě na trombomodulin aktivuje protein C na aktivní enzym (APC) a není již schopen zasáhnout do procesů srážení krve (negativní zpětná vazba).

Vedle koagulace zasahuje trombin i v jiných systémech. Obecně hraje důležitou roli při poranění v procesech zástavy krvácení, zánětu a hojení.[18]

Z tohoto důvodu je popis koncentrace trombinu v čase vynikajícím nástrojem k získání celkového obrazu koagulability.

2.3.1Důvody k měření trombinu

Hemostaticko – trombotický systém je díky velkému množství pozitivních a negativních zpětnovazebních kontrol tak složitý, že je prakticky nemožné posuzovat celkovou hemostatickou funkci krve z koncentrace nebo struktury jejích jednotlivých složek. Proto individuální podrobné informace o těchto složkách nejsou alternativou pro celkový funkční test. Koagulační časy (APTT, PT, TT) nepostihují hyperkoagulační stavy a nejsou citlivé k lehkým krvácivým projevům. [8, 10]

Na zástavě krvácení a prevenci trombózy se podílí správné umístění a rychlé zesílení účinku proteáz odpovědných za tvorbu trombinu v místě poranění cévy a inhibice proteáz jinde v cirkulaci. Srážlivost je definovaná jako možnost tvorby trombinu a enzymatické práce, kterou trombin vykonává. Měření generace trombinu a jeho enzymatického potenciálu nám poskytuje metoda kvantifikující účinky četných faktorů, které určují koagulační kapacitu, a popisující vliv prostředí na tyto faktory. [1]

Generace trombinu je klíčový proces určující kvalitu hemostatického procesu. Následující přeměna trombinu je rozhodující pro pevnou fibrinovou síť. Během svého působení učiní trombin velké množství vysoce regulovaných pochodů v krvi a cévní stěně, včetně přeměny fibrinogenu. Nevhodná generace trombinu může vést k patologickým stavům, především ke krvácivým nebo trombotickým onemocněním. Koagulační systém je obvykle vyšetřován dvěma hlavními koagulačními testy, aktivovaným parciální tromboplastinovým testem (APTT) a protrombinovým časem (PT), které určují pouze čas do tvorby koagula a úplně neposoudí celkovou hemostatickou rovnováhu. Ač už jsou mechanismy in vitro testů pevně zavedené, nejsou vždy zrcadlové k patologiím, které souvisí s krvácením nebo trombózou. Nedávný vývoj nových testů stanovil plynulé zaznamenávání generace trombinu za in vitro podmínek, které velmi blízce napodobují in vivo podmínky. To přimělo k prozkoumání rovnováhy mezi prokoagulační a antikoagulační aktivitou u pacientů s různými poruchami hemostázy. Trombin generační test (TGA) neudává jen celkové posouzení hemostázy, ale zaměřuje se také na mimokoagulační schopnost vytvořeného trombinu, jakožto silného agonisty velkého množství buněčných aktivací kaskády. [2, 3, 9]

Normální hemostáza je charakterizována dynamickou rovnováhou mezi jejími prokoagulačními a antikoagulačními složkami. Tato rovnováha a jeho potenciál jsou posunuty v odpovědi na podněty. Tento posun je v současnosti stanoven pouze jedním měřením nebo někdy i několika stupni faktorů a následně předpovídá, jaký bude jejich účinek na schopnost celého systému generovat trombin. Různí jedinci mají různý trombin generační potenciál a z tohoto důvodu rozdílný koagulační fenotyp. Pravděpodobně se tento fenotyp s časem a dalšími okolnostmi mění (přibývající věk, gravidita, užívání preparátů obsahující estrogen). Přímé měření trombinového potenciálu je zapotřebí, jestliže je prozkoumán vztah mezi individuální schopností generovat trombin a jejím koagulačním fenotypem. [1]

TGA je jediný standardizovaný funkční test tromboticko – hemostatického systému. Klasické screeningové testy (PT, aPTT) nepostihují trombotické riziko. Pro tyto případy by měl být použit takový test, který přesně předpoví individuální koagulační schopnost. To je z klinického hlediska nesmírně důležité. Takový test by měl ideálně detekovat protrombotické stavy a korelovat s klinickými závěry, korelovat s klinickým sledováním krvácení u vrozených a získaných stavů omezené hemostatické kapacity a naznačovat kvantitatativní účinek antitrombotické léčby (prokoagulační a antikoagulační) navzdory jejímu zařazení, např. zda se jedná o druhotný účinek heparinu nebo antagonistu vitamínu K, přímý inhibitor trombinu nebo protidestičkovou léčbu. [7, 17, 16]

Nyní je k dispozici přímý, plně automatizovaný test pro měření generace trombinu a ten by mohl být lepším ukazatelem intenzity antikoagulační léčby. [9, 23]

3Experimentální část

3.1Cíl práce

Cílem mé bakalářské práce bylo zhodnotit poznatky o generaci trombinu a porovnat naměřené parametry trombin generačního testu se současně měřenou hodnotou INR Quickova testu u dětských pacientů léčených warfarinem. Záměrem bylo přijít na to, do jaké míry je generace trombinu ovlivněna touto antikoagulační léčbou. Díky tomu, že trombin generační test je ukazatelem celkové hemostatické rovnováhy, je možno průběžně sledovat nejen výsledky antikoagulační léčby, ale i některé patologie hemostatického systému.

3.2Princip použité metody

3.2.1Obecný princip fluorescence

Fluorescence je druh luminiscence, u níž dochází k emisi světla jen po dobu, kdy je buzena. Luminiscence je emise záření spontánně nastávajícího při přechodu molekuly z excitovaného stavu do základního. Tímto dojde k vyzáření fotonu. Luminiscenci látky lze tedy pozorovat po jejím ozáření jiným zdrojem. Ta se dělí na fotoluminiscenci (fluorescence, fosforescence) a chemiluminiscenci.

• 
  Fotoluminiscence – excitace je způsobena absorbcí záření viz schéma č. 2
  

• 
  Chemiluminiscence – excitace je vyvolána chemickou reakcí
  

Pokud po odstranění zdroje ozařování látky luminiscence vymizí, jedná se o fluorescenci. Pokud luminiscence přetrvává i po odstranění zdroje ozařování, mluvíme o fosforescenci, která může trvat až několik minut.
Luminofory

Látky, u nichž nastává luminiscence. Jsou to převážně pevné látky s příměsmi vytvářejícími tzv. luminiscenční centra (např. ZnS, CdS s příměsí Ag, Cu, Mg aj.) [22]

Schéma č. 2: Schéma zářivých a nezářivých přechodů fotoluminiscenční molekuly (Jablonského diagram)

Nezářivé přechody:
VR – vibrační relaxace

IC – vnitřní konverze

ISC – mezisystémová konverce

Zářivé přechody:
Fluorescence (FL) – přechod do nižšího elektronového stavu se stejnou multiplicitou S₁→S₀, spinově povolený přechod
Fosforescence (Ph) – přechod mezi stavy s různou multiplicitou T₁→S₀, spinově zakázaný přechod

Rozdílu v energiích mezi maximy absorpčního a emisního pásu se říká Stokesův pokus. (Obr. č. 4)

Obr. č. 4: Stokesův pokus

3.2.2Princip trombin generačního testu

Trombin generační test je fluorescenční funkční test pro analýzu a monitorování hemostatického systému. Test je založený na tvorbě trombinu, který nám v průběhu měření poskytuje aktuální komplexní obraz hemostázy a maximálně se snaží přiblížit in vivo podmínkám. Metoda využívá fluorometr a používá trombinový kalibrátor, který je nutný ke korekci vnitřních filtrových efektů, variability v barevnosti plazmy apd. Princip měření spočívá v tom, že se přidá do plazmy pacienta (chudé či bohaté na trombocyty) fluorogenní substrát, který je po aktivaci koagulační kaskády přídavkem směsi fosfolipidů (pouze u plazmy chudé na trombocyty), tkáňového faktoru a Ca²⁺ přeměněn vznikajícím trombinem na fluorofor a signál je kontinuálně zaznamenáván fluorometrem. Přesněji, měří se fluorescence produktu aminomethylkumarinu při vlnové délce 390/460 nm (excitace/emise), který vzniká přeměnou flurogenního substrátu působením trombinu (Schéma č. 3).

Protrombin

Trombin


Schéma č. 3: Princip trombin generačního testu

• 
  Do plazmy je přidán fluorogenní substrát
  

• 
  Vznikající trombin přeměňuje substrát na fluorofor
  
• 
  Signál je průběžně zaznamenávám fluorometrem
  

Vznikající fluorogenní signál není úměrný aktivitě trombinu, závisí na spoustě faktorů, jako jsou barva plazmy, se snižující se koncentrací substrátu klesá rychlost jeho přeměny, fluorescence není lineární s koncentrací fluoroforu, signál se liší přístroj od přístroje apod. Proto je nutné při měření používat trombinový kalibrátor.

3.2.3Trombinový kalibrátor

Aktivita trombinu je porovnávána s aktivitou enzymu o známé koncentraci. V průběhu tvorby trombinu je zpětně trombin produkován a inhibován. Princip této metody je postaven na přeměně fluorogenního substrátu tímto trombinem. Fluorogenní signál je pak přímo úměrný množství trombinu v čase. Nemůže však být porovnána koncentrace trombinu v plazmě, v níž byl vytvořen, s aktivitou trombinu o známé koncentraci přítomnou v dalším vzorku této plazmy. Přidání trombinu do plazmy by mohlo okamžitě aktivovat koagulační kaskádu, vytvořit sraženinu a mohl by být inhibován antitrombinem. Z tohoto důvodu je při měření používán kalibrátor, směs, která je velmi blízce podobná trombinu, avšak není inhibována plazmatickými inhibitory a nereaguje s žádným jiným substrátem přítomným plazmě, kromě fluorogenního substrátu, který je do plazmy přidáván. Ačkoli aktivita není nijak inhibována, výsledkem reakce této směsi není přímá čára, ale zahnutá křivka (Obr. č. 5, 6). To je způsobeno dvěma odlišnými účinky: poměr mezi koncentrací fluoroforu a množstvím fluorescenčního signálu není úměrný a spotřeba fluorogenního substrátu klesá v čase. Počáteční sklon měřené kalibrační křivky je úměrný známému množství kalibrátoru. Protože tento počáteční sklon je také závislý na zbarvení plazmy, je důležité, aby byl kalibrátor měřen ve stejné plazmě, ve které byl měřen trombin. [1, 8]

Obr. č. 5: Kalibrační křivka



Obr. č. 6: Měřený signál vs. výsledná křivka

3.2.4Měření

Stejný vzorek je měřen za dvou podmínek (ve dvou oddělených jamkách mikrotitrační ELISA destičky). V první jamce probíhá v přítomnosti fluorogenního substrátu generace trombinu. Ve druhé jamce generace trombinu nenastává, ale fluorescenční substrát je převeden na fluorescenční signál pomocí trombinového kalibrátoru (Schéma č. 4).

V první jamce probíhá generace trombinu,

ve druhé je měřen trombinový kalibrátor.

Schéma č. 4: Průběh měření TGA

3.2.5Vyhodnocení výsledků

Výstupem testu je trombinogram (Obr. č. 7), který popisuje koncentraci trombinu v čase. Celá reakce sestává z několika sestává z několika fází, z nichž pro vyhodnocení stanovení je nejdůležitějších 5 bodů:

1. 
   Lag time – čas od iniciace k první detekovatelné generaci trombinu
   
2. 
   Peak Height - vrchol píku – značí nějvětší vytvořenou koncentraci trombinu
   
3. 
   ETP – endogenní trombinový potenciál je celkové množství vytvořeného trombinu udávané v nM*min
   
4. 
   Time to Peak – čas do vytvoření největší koncentrace trombinu udávaný v minutách
   
5. 
   Start tail – čas, kdy končí generace trombinu
   

Obr. č. 7: Trombinogram