Mühazirə- 15 Biotexnologiya və gen mühəndisliyi

Genlərin genomdan ayrılması
İlk dəfə J.Beksvit əməkdaşları ilə transduksiya üsulu əsasında geni genomdan ayırmağa müvəffəq olmuşlar. Onlar göstərmişlər ki, lyambda bakteriofaqı E.coli hüceyrəsində çoxalarkən bakteriyanın laktozlu operonunu ona bitişmiş requlyator-geni ilə bütövlükdə tutub öz genomuna quraşdıra bilər. E.coli-nin DNT-nin bir fraqmenti lyamda faqının genomunda müəyyən qaydada qurulur. Əvvəl quraştırası genlər z, a, y sonra operator – o, promotor – r və nəhayət tənzimləidici – i genləri gəlir. Denaturasiya və sentrifuqlaşdırma tətbiq edərək faqın – DNT-sindən E.coli – nin laktoz operonu və tənzimləidici – genini ayırmışlar.
Təəssüflər olsun ki, bu üsul məhz bu gen üçün istifadə edilə bilər və genetik mühəndislikdə geniş istifadə oluna bilməz.
Hazırda genetik mühəndislik bir çox üsullardan istifadə edir. Bu üsullar əsasında DNT molekulundan eyni zamanda istənilən genin fraqmentini ayırıb, vektora quraşdıraraq onu bilavasitə çoxaldıb resepiyent hüceyrənin genomuna yerləşdirmək olar.Tərkibində gen olan DNT fraqmentini əksər hallarda restriktaza fermentinin vasitəsilə alırlar.
Bu fermentlər DNT molekulunu nukleotid yerləşən dəqiq, müəyyən yerdən kəsirlər. Məsələn, restriktaza E.coli DNT telini dəqiq adenin ilə quanin arasında kəsir. Q.AATT və yaxud TTAA.Q (nöqtə DNT telinin kəsildiyi yeri göstərir). Bunun nəticəsində bir-birinə komplementar olan nukleotidlərin ardıcıllıqlarının (AATT və TTAA) «yapışqan ucları» əmələ gəlir ki, bunların vasitəsilə onlar birləşir.
Plazmidlər, bakteriofaqlar, viruslar, kosmidlər vektor ola bilərlər (vektor sözü lat. vector, yəni aparan, daşıyıcı deməkdir).
Vektor öz tərkibinə müəyyən genə müvafiq olan DNT fraqmentlərini daxil edir və onları resipiyent hüceyrəyə köçürür.
Plazmidlər – bakteriyaların tərkibində olan xırda həlqəvari DNT molekuludur. Onlar əlavə genetik məlumatı xromosomların DNT-sindən asılı olmayaraq müstəqil replikasiya etməyə qadirdirlər. Bəzi plazmidlər bakteriyaların xromosomlarına daxil olub qurulmaq və oradan təzədən çıxmaq xüsusiyyətinə qadirdilər, bəziləri bir hüceyrədən digərinə keçə bilirlər. Genetik mühəndislikdə ən çox üç tip plazmidlərdən istifadə olunur, bunlar F, P və Col simvolları ilə işarə olunur.
Vektor kimi rekombinant (hibrid) plazmidlər istifadə edilir. Rekombinant plazmidlərin alınması üsulunu ilk dəfə P.Berq əməkdaşları ilə birlikdə 1972-ci ildə işləyib hazırlamışdır. Onlar, tərkibində E.coli-nin qalaktoz operonu olan rekombinant plazmid almışlar. Hazırda, müxtəlif vektor almaq üçün 30-dan çox sistem məlumdur. Rekombinant plazmidləri almaq üçün aşağıdakı üsulu misal kimi çəkmək olar. Məsələn PBR 322 plazmidin DNT və tədqiqatçını maraqlandıran orqanizmin DNT-ni restriktaza fermenti ilə (məsələn, Bam 1) emal edirlər, bu ferment DNT-ni dəqiq, müəyyən yerdə kəsir və yapışqan uclar əmələ gətirir.
Sonra hər iki preparatları bir-biri ilə qarışdırırlar, bunun nəticəsində plazmidin DNT-nin fraqmentləri və donorun DNT-si, yapışqan uclarla birləşir və rekombinant DNT molekulunu əmələ gətirir. Bundan sonra tərkibində müvafiq gen olan rekombinant plazmidi müəyyən selektiv mühitdə seçirlər.
1974-cü ildə D.Xelinskiy əməkdaşları ilə triptofan aminturşusunun sintezini kodlaşdıran genləri, ColEJ plazmidin DNT-nə daxil etmiş və sonra rekombinə olunmuş plazmidini E.coli bağırsaq çöpünün hüceyrələrinə keçirmişdir. Sonra həmin bakteriyaları xloramfenikol ilə emal etmişlər, bunun nəticəsində həmin rekombinant plazmidin bir hüceyrədə sayı 400-500-ə qədər artmış və bu hüceyrələrdə triptofan aminturşusunu hasil etmək qabiliyyəti qat-qat artmışdır. Bu yolla hepatit B virusuna, ağız yarası (dabağ), qrip, adenovirus və s. xəstəliklərə qarşı vaksinlər yaranmışdır.
Plazmidə təbii və yaxud sintez olunmuş genləri daxil etmək olar. Rekombinant plazmid bakteriya hüceyrəsinə daxil ediləndən sonra orada müstəqil işləyir və fəaliyyət göstərir, çoxalır və yaxud bakteriyanın xromosomunun DNT-nə daxil olur. Bu üsulla bakteriya hüceyrələrinə insan genləri də daxil edilmiş və somatostin, intenferon, bradikinin, insanın, öküzün və digər heyvanların boy hormonlarını hasil edən bakteriya ştammları yaranmışdır.
1980-ci ildə plazmid vasitəsilə E.coli hüceyrəsinə insan bədənində insulin sintezinə nəzarət edən gen daxil edilmişdir. Bunun üçün insan hüceyrələrindən insulinin sintezini kodlaşdıran yetkin mRNT-si yarılmışdır. Əks transkriptaza vasitəsilə bu mRNT-dən kDNT-nin komplementar nüsxəsi alınmışdır. mRNT-nin zənciri qırılmış və DNT-polimeraza fermenti vasitəsilə DNT-nin ikinci teli sintez edilmişdir. Sintez edilmiş geni vektora quraşdırmaq üçün onun ucuna liqaza fermentinin köməyilə linker adlanan nukleotid ardıcıllıqlarının qısa fraqmentləri «tikilmişdir». Bu fraqmentlər Bam1 restriktaza ilə tanınır. Plazmidi və kDNT-ni restriktaza Bam1, sonra liqaza fermenti ilə emal edirlər və nəticədə rekombinant plazmid alınır. Bu plazmidi, pro-insulin sintez etməyə qadir olan bakteriya hüceyrəsinə daxil edirlər.
Çox vaxt vektor kimi viruslardan istifadə edirlər. Onlar heyvan orqanizminə asanlıqla daxil olur. Genetik mühəndislikdə meymunun onkogen virusundan (OB40) geniş istifadə edirlər. Onların DNT-si 5200 nukleotid cütündən ibarət olan xırda viruslara aiddir. Bu virusun genomu məməlilərin hüceyrələrinin xromosomlarına daxil olub qurulmaq qabiliyyətinə malikdirlər.
OB40 vasitəsilə siçanın və dovşanın hemoqlabin betta-zəncirini kodlaşdıran genlər meymun hüceyrələrinə keçirilmiş və orada aktiv fəaliyyətə başlamışlar.
Bakteriofaq lyamdanın kiçik DNT fraqmentinin və plazmidin birləşməsi nəticəsində alınan vektor kosmid adlanır. Kosmid 35-40 min nukleotid cütündən ibarətdir. Bu vektor vasitəsilə in vitro becərilən bakteriya, bitki və heyvan hüceyrələrinə bu və digər genlər köçürülə bilər.
Genlərin bir başa heyvan hüceyrələrinə köçürülməsi böyük maraq kəsb edir, lakin bu problem hələ işlənib hazırlanmaqdadır. 1982-ci ildə R.Palmitter əməkdaşları ilə, siçanın mayalanmış yumurtalarının erkək pronukleusuna siçovulun boy hormonu sintez edən genini daxil etmişdir.
Vektor vəzifəsini ifa edən həmin genlə birləşmiş rMGN plazmidi olmuşdur. Siçovulun boy hormonunu idarə edən gen 353 nukleotid cütündən ibarətdir. Bu genin tərkibində rekombinant plazmidin 600 nüsxəsi olaraq məhlul şəklində siçanın 170 yumurta hüceyrələrinə daxil edilmişdir, sonra bu yumurta hüceyrələri bir qrup siçanların balalığına daxil edilmişdir. Bu siçanlardan 21 siçan balası alınmış və onların 6-da nəhənglik əlamətləri meydana çıxmışdır. Nəhəng fərdlərin qaraciyər hüceyrələrində boy hormonunun sintezini kodlaşdıran küllü miqdarda mRNT var idi, qanda isə bu hormonun yüksək konsentrasiyası qeyd olunmuşdur.
Xromosom və genom səviyyəsində genetik mühəndislik
Genetik mühəndisliyin bir bölməsi tətbiqi yolla xromosomu bütövlükdə bir hüceyrədən digərinə köçürmə üsullarını işləyib hazırlamaqdır. Donor-hüceyrəsinin metafaza mərhələsindən xromosomu ayırıb piknositoz üsulu ilə resipiyent hüceyrəyə daxil etmək olar. Piknositoz – yunan sözü pyknoz – bərk, tez-tez və sytos – hüceyrə deməkdir. Yad hüceyrəyə daxil olan xromosom xırda fraqmentlərə parçalanır; onlardan bəziləri bir çox nəsillər boyu resipiyent hüceyrənin sitop­lazmasında qala bilir.
Həmin fraqmentlərin tərkibində olan DNT, polipeptidlərin sintezini həyata keçirə bilər. Məsələn, timidinkinaza və qalaktokinazaların sintezinə nəzarət edən və insanın 17-ci xromosomunda yerləşən genlər (in vitro) siçan hüceyrələrinə keçirilmişdir.
Həmin genlər siçan hüceyrələrində çoxalaraq sərrast iş­ləyirdilər. S.M.Qerşenzon bu üsulun tibbdə ağır irsi xəstəlik olan talassemiyanı müalicə etmək üçün istifadəsinin misalları­nı çəkir. Bu xəstəlik qlobin zülalların-alfa və betta- polipeptid zən­­cirlərini kodlaşdıran genlərin mutasiyası nəticəsində baş verir.
Talassemiya xəstəliyinə tutulmuş adamın qan istehsal edən sümük iliyindən bir qədər götürüb, orqanizmdən kənar hüceyrə kulturasında çoxaldırlar, sonra genetik mühəndislik üsulu ilə onların daxilinə qlobini kodlaşdıran normal genləri daxil edirlər və bunlar qırmızı qan cisimciklərinin (eritrositlərin) normal inkişafını təmin edir. Belə hüceyrələri təzədən xəstənin beyin sümüyünə daxil edərək onlar patoloci olan mutant eritrositləri əvəz edir.
Heyvanlarda, bir heyvan hüceyrəsinin nüvəsini digər heyvanın hüceyrəsinin sitoplazmasına köçürmək böyük maraq kəsb edir və bunun nəticəsində sibrid alınır. Məsələn, siçandan mayalanmamış yumurta hüceyrəsini ayırıb oraya digər orqanizmin somatik hüceyrəsinin nüvəsini daxil edərək mayalanmaya hormonal hazır olan dişi siçanın balalığına həmin hüceyrəni transplantasiya edirlər. Alınan nəsil genetik olaraq tamamilə nüvəsi götürülən fərdə oxşayır.