O’simlik to’qimalaridan dnk ni ajratib olish

5) Dneasy Tissue Kit (Germaniya) reagentlar to’plami yordamida DNK ajratish uslubi.
Dneasy Tissue Kit (QIAGEN GmbH, Germany) reagentlar to’plami afzalligi jinsiy voyaga yetgan nematodalarning 10 mg to’qimasidan tashqari, juda kichik o’lchamdagi nematodalarning lichinkasi yoki tuxumidan genom DNKsini ajratish olish mumkin (5.4-rasm). Bunda nematoda to’qimasining kichik bo’lagi ajratib olinadi yoki pipetka bilan 1-2 dona lichinka yoki tuxumi olinadi va 1,5 ml li “Ependorf” probirkasiga solinadi. Namunalar og’irligi 10 mg dan oshmasligi kerak.

5.3 rasm. Dneasy Tissue Kit (QIAGEN GmbH, Germany) reagentlar to’plami

1. 
   Biologik materialga 180 mkl ATLbuferi solinadi.
   
2. 
   20 mkl proteinaza K qo’shiladi va vorteksda 15 sek davomida aralashtiriladi. Probirkalar termostatda 55°S haroratda biologik materialning to’liq parchalanishiga qadar inkubatsiya qilinadi. Namunalarni 1-3 soatga yoki kechasiga 18 soatga qoldirish mumkin.
   
3. 
   15 sek davomida vorteks qilinadi, keyin 200 AL buferi qo’shilib, 15 sek vorteksda aralashtiriladi, 70°S haroratda 10 minut inkubatsiya qilinadi.
   
4. 
   So’ngra 200 mkl etanol (96-100% li) qo’shib, vorteksda gomogen eritma hosil bo’lguncha aralashtiriladi.
   
5. 
   Har bir gomogen ehtiyotkorlik bilan (Dneasy Mini spin column) filtirli epindorf probirkalarga solinib, qopqoqlari berkitilib 1 minut davomida 8000 aylG’min tezlikda tsentrafuga qilinadi.
   
6. 
   Epindorfga o’tgan toza suyuqlikni 2 ml li probirkalarga o’tkazilib, ustiga 500 mkl AW1 solinib 1 minut davomida 8000 aylG’min tezlikda tsentrifuga qilinadi.
   
7. 
   Toza suyuqlikni 2 ml li filtirli probirkalarga o’tkazilib, ustiga 500 mkl AW2 bufer solinib filtrdan suyuqlik to’liq ajralguncha 14 000 aylG’min tezlikda 3 minut davomida tsentrifuga qilinadi.
   
8. 
   Filtrli epindorfni boshqa 1,5 ml li yoki 2 ml li probirkalarga o’tkaziladi va ustiga 50-100 mkl AE bufer yoki distillangan suv solinadi, so’ngra xona xaroratida 2 minut inkubatsiya qilinadi va 8000 aylG’min tezlikda 1 minut tsentrifuga qilinadi. Buferda erigan DNK -20°S haroratda saqlanadi.
   
9. 
   Elyuat olish jarayonini 8 - bosqichga ko’ra takrorlash mumkin.
   

Bundan tashqari, hozirgi vaqtda nuklein kislotalarni avtomatik ravishda ajratib olish uchun bir necha priborlar ishlab chiqarilagn (4-rasm).

1. 
   4-rasm. MagPurix 12s tizimi yordamida NK avtomatik ravishda ajratib olish bosqichlari. NK ajratib olishda moddalarni ajratishda magnit shariklari yordamiga asoslangan.