Giemsa Boyama: Kan parazitlerinin aranmasında ve boyanmasında yaygın olarak kullanılan bir yöntemdir. Kalın damla yöntemiyle hazırlanmış frotiler ya da yayma frotiler havada (oda ısısında) kurutulduktan sonra absolut metanol içerisinde 5 dakika boyunca tespit edilir. Süre sonunda froti tekrar havada kurutulur ve hazırlanmış olan giemsa boya solüsyonu içerisinde 35 dakika boyunca boyamaya bırakılır. Boyama işleminin bitiminde preparat boya solüsyonu içerisinden çıkartılarak hafif akan çeşme suyu altında fazla boyalarından arındırıldıktan sonra tekrar havada kuramaya bırakılır. Froti tamamen kuruduktan sonra immersiyon yağı damlatılıp mikroskop altında x100 objektifte incelenir.
NOT: Giemsa boya solüsyonunun hazırlanışı; Giemsa stok solüsyonunun (Merck) 1:20 oranında sulandırılmış şeklidir. Hazırlanmasında distile ya da deiyanize su kullanılması bayamanın kalitesini artırır. Bu amaçla 100 ml’lik mezür içerisine 95 ml distile su konulur, bunun üzerine puor yardımıyla 5 ml giemsa stok solüsyonu damla damla mezürün kenarından akacak şekilde eklenir. Daha sonra mezür hafif şekilde, çalkalamadan dairesel hareketlerle karıştırılıp bir şale içerisine konulur. Hazırlanan boyama solüsyonunun taze olması boyanma kalitesi yönünden önemlidir.
May-Grünwald Boyama: Froti hazırlanır. Boya alkol içerdiği için tespit etmek gerekmez. Kanlı kısım yukarıda kalacak şekilde boyama köprüsüne yerleştirilir. May-grünwald boyadan froti üzerini tamamen kaplayacak şekilde boya konulur. Boyama işlemi üç dakikada tamamlanır. Froti üzerindeki boya dökülüp saf su içinde bir dakika bekletilir. Daha sonra froti havada kurutulur ve immersiyon yağı damlatılıp mikroskopta x100 objektifte incelenir.
Leishman Boyama: Bu boyama yöntemi, hem kan hem de dokulardan yapılan preparatları incelemek için kullanılır. Boyanın hazırlanmasında 0,2 gram Leishman boyası 100 ml metil alkol içerisinde karıştırılarak tamamen eritilir. Örneğin ayrıca tespit edilmesine gerek yoktur. Boyanacak froti boyama köprüsüne yerleştirilir, hazırlanmış boyadan üzerine 6–7 damla eklenerek 30–60 saniye boyanır (fazla beklenirse boya çökelti oluşturur. Süre sonunda boya miktarının iki katı (12–14 damla) distile su preparat üzerine eklenir ve 5–10 dakika beklenir. Daha sonra preparat üzerindeki boya dökülür ve distile su ile dolu şale içerisine daldırılıp yıkanır. Havada kurutulup x100 objektifte incelenir.
Diğer Tanı Materyalleri
Kan ve dışkı haricinde protozonların teşhiste kullanılan çeşitli tanı materyalleri şunlardır;
Duodenal Materyal: Gerekli durumlarda giardiosis enfeksiyonunun saptanmasında kullanılabilen bir yöntemdir. Endoskobi ile hastalardan alınan 0,5–3 ml duodenum aspirasyon sıvıları direkt olarak laboratuarda incelenebilir.
Ürogenital Materyal: Trichomonas vaginalis, T.foetus gibi ürogenital sistemde görülen protozoal trophozoitlerin tanısında kullanılmaktadır. Bu amaçla akıntı örnekleri ya da swaplar kullanılabilir.
Balgam Sıvısı: Pneumocystis carnii başta olmak üzere, Entamoeba histolytica, E.gingivalis, Trichomonas tenax, Cryptosporidum parvum etkenlerinin tespitinde baş vurulbilen bir yöntemdir. İyi bir örnek almak için sabah erken saatlerde materyal alınır ve hastanın ağzı önce hidrojen peroksit ile yıkanır daha sonra aşağı solunum yollarından gelen materyal alınmalıdır. Alınan materyal laboratuara kapalı kapaklı tüplerde ve acil olarak iletilmelidir. Balgam örneklerinin alınmasında mukolitik ajanların kullanılması özellikler hayvanlarda örneğin alınabilmesi açısından fayda sağlayabilir.
Aspirasyon Meteryalleri: Birçok enfeksiyonlarda etkenlerin rutin teknikler kullanılarak görülemediği durumlarda aspirasyon materyallerinin incelenmesi önem taşımaktadır. Amiblerin değerlendirilmesi için, amip apselerinden ve daha önemlisis apsenin etrafından alınan aspirasyon materyalinin değerlendirilmesi önemlidir. Giardia intestinalis ve Cyrptosporidium parvum’undeğerlendirilmesinde alınan duodenal sıvı hazırlanan nativ ve boyalı preparatlarda incelenmelidir. Leishmania amastigotları ile Theileria şizontlarının değerlendirilmesinde alınan lenf aspiratları, yine Leishmania, Trypanasoma cruzi amastigotları ile Plasmodium türlerinin değerlendirilmesinde alınan kemik iliği aspirasyon sıvılarının gieamsa ile boyanarak incelenmesi önemlidir. Leishmania donovani, trypanasoma gambiensei Tryp, rhodasiense tanısı için lenf bezleri, kemik iliği ve dalaktan alınan aspirasyon materyali tanıda önemlidir. Serbest yaşayan patojen amiplerden Naegleria fowleri, Acantomoeba türleri, Afrika trypanasoma etkenleri (T.B.gambiemse, T.b. rhodesiense) tanısında beyin-omurlilk sıvısı (BOS) kullanılabilir.
Biposi Materyali: Dokularda yaşayan etkenlerin tanısında biopsi materyali kullanılabilir. Bu amaçla deri, kas, kornea, barsak, karaciğer, akciğer ve beyinden alınan biopsi parçaları önce direkt inceleme veya boyama için ezme veya baskı şeklinde yayma preparatlar hazırlanarak uygun bayam yöntemleri ile boyanarak incelenir. Primer ve sekonder amebiosis, Trypanasomiasis, Chagas, Toxoplasmosis, Sarcosporidiosis, Sıtma, Leismaniosis, Theileriosis gibi protazoal hastalıkların teşhisinde sıkça başvurulan bir yöntemdir. Lenf örnekleri boyanarak incelenir. Köpeklerde Visceral Leismaniosis’in teşhisinde popliteal lenf yumrusu, karaciğer veya dalaktan alınan biyopsi örnekleri tanıda büyük fayda sağlar. Sığırlarda Theileriosis’in erken dönemde teşhisinde şişkin lenf yumrularından hazırlanan frotilerin önemi büyüktür.
Doku ve Hücre Kültürü ile Etkenlerin Belirlenmesi
Bu yöntemde kan ve dokularda yaşayan etkenlerin uygun yöntemler (kan, biopsi vb.) ile izole edildikten sonra konak vücudunda yaşamalarına olanak verecek benzeri bir ortam (besi yeri) içerisinde üretilmeleridir. Hastalıkların (Leishmaniosis, theileriosis, babesiosis vb.) teşhisinde de kullanılan bir yöntem olmasına karşı oldukça zahmetli, uzun zaman alan ve özel ekipmanlar gerektiren bir yöntemdir.
Protozoonların Organlara Göre Dağılımı
Parazitler, hayat döngüleri sırasında, konakçıların farklı organ ve dokularında yerleşirler. Bu yerleşim yerleri birçok parazit türü için özeldir. Bu sayede, parazititn yerleştiği doku veya organ temel alınarak, bazı parazit türleri direkt olarak teşhis edilebilmektedir. Ancak, bu özellik tüm parazit türleri için geçerli değildir. Özellikle boyut olarak oldukça küçük olan (4–60 mikrometre) protozoon türleri göz önüne alındığında organlarda bu parazitlerin görülmeleri mümkün olmamakta, bununla beraber incelenen organlara oluşan birtakım özgün ya da patognomonik lezyonlar ile teşhise gidilebilmektedir. Farklı doku ve organlarda görülebilen protozoon türlerine ait Tablo 1’de verilmiştir.
