Resmî Gazete Sayı : 27189 YÖnetmeliK

Ek–3

ETKENİN TANIMLANMASI, BRUSELLOZ TESTLERİ

VE REFERANS LABORATUVARLARI

             A – Etkenin tanımlanması

             1 – Abort materyalinde, vajinal akıntılarda veya sütte Brusella organizmalarının morfolojilerinin modifiye asit–fast ya da immünspesifik boyama ile gösterilmeleri, özellikle de serolojik testlerle desteklendiğinde, brusellozun varlığına işaret eden bulgulardır. İzolasyondan sonra faj lizis ve/veya oksidatif metabolizma testleri, kültürel, biyokimyasal ve serolojik kriterler ile tür ya da biyovarın tanımlanacaktır. Kullanılan teknik ve vasatlar ile bunların standardizasyonu ve sonuçların yorumlanması OIE Diyagnostik Testler ve Aşılarla İlgili Standartlar Rehberi’nde, Sığır Brusellozu ve Koyun Keçi Brusellozu teşhisi için belirtilen güncel uygulamalarla uyumlu olacaktır.

             B – Bruselloz testleri

             1– İmmunolojik testler.

             2– Standartlar.

             a) Roz Bengal testi (RBT), serum aglütinasyon testi (SAT), komplement fiksasyon testi (CFT) ve süt ring testinde (MRT) kullanılan bütün antijenlerin hazırlanmasında Brusella abortus biyovar 1 Weybridge suş No 99 ya da USDA suşu 1119–3 kullanılır.

             b) RBT, SAT, CFT ve MRT için standart referans serum OIE uluslararası referans standart serumu (OIEISS) olup bu serum WHO ikinci uluslararası anti–Brusella abortus serumu (ISAbS) olarak da isimlendirilmiştir.

             c) ELISA testleri için standart referans serumlar aşağıda belirtilmiştir;

             (1) OIEISS,

             (2) Zayıf pozitif OIE ELISA standart serumu (OIEELISAWPSS),

             (3) Kuvvetli pozitif OIE ELISA standart serumu (OIEELISASPSS),

             (4) Negatif OIE ELISA standart serumu (OIEELISANSS).

             ç) OIEISS, OIEELISAWPSS, OIEELISASPSS ve OIEELISANSS kendilerinden yola çıkılarak, her bir test için oluşturulması zorunlu olan ikincil ulusal referans standartlarının (çalışma standartları) hazırlandığı uluslararası birincil standartlardır.

             3– Serum ya da sütte sığır brusellozunun tespitinde kullanılan enzim–linked immunosorbent assay (ELISA) veya diğer bağlayıcı testler aşağıdaki gibidir;

             a) Materyal ve ayıraçlar, kullanılan teknik ve sonuçların yorumlanması OIE Diyagnostik Testler ve Aşılarla İlgili Standartlar El Kitabı yer alan prensipler ile uyumlu olmalı ve en azından laboratuvar ve diyagnostik çalışmaları içermesi gerekmektedir.

             b)  Testin standardizasyonu.

             (1) Test prosedürünün individüel serum örnekleri için standardizasyonu:

             Negatif serum içinde (ya da negatif toplu serum örnekleri içinde) hazırlanan OIEISS’in 1/150 ön–dilüsyonu veya OIEELISAWPSS ‘ın 1/2 ön–dilüsyonu veya OIEELISASPSS’ın 1/16 ön–dilüsyonunun pozitif reaksiyon vermesi gerekir.

             Negatif serum içinde (ya da negatif toplu serum örnekleri içinde) hazırlanan OIEISS’ın 1/600 ön–dilüsyonu veya OIEELISAWPSS’ın 1/8 ön–dilüsyonu veya OIEELISASPSS’ın 1/64 ön–dilüsyonunun negatif reaksiyon vermesi gerekir. OIEELISANSS’ın daima negatif reaksiyon vermesi gerekir.

             (2) Havuz serum örneklerinin test prosedürünün standardizasyonu:

             Negatif serum içinde (ya da negatif toplu serum örnekleri içinde) hazırlanan ve havuzu oluşturan örnek sayısı kadar negatif serumla tekrar dilüe edilen OIEISS’ın 1/150 ön–dilüsyonuveya OIEELISAWPSS’ın 1/2 ön–dilüsyon veya OIEELISASPSS’ın 1/16 ön–dilüsyonunun pozitif reaksiyon vermesi gerekir. OIEELISANSS’ın daima negatif reaksiyon vermesi gerekir.Testin, serumlarından havuz oluşturulmuş bir hayvan grubu içerisindeki tek bir hayvanda enfeksiyon belirtisini yeterli düzeyde tespit etmeye yeterli olması gerekmektedir.

             (3) Havuz oluşturulmuş süt veya peynir altı suyu test prosedürünün standardizasyonu:

             Negatif serum içinde (ya da negatif toplu serum örnekleri içinde) hazırlanan ve negatif süt ile 1/10 oranında tekrar dilüe edilen OIEISS’ın 1/1000 ön–dilüsyonu veya OIEELISAWPSS’ın 1/16 ön–dilüsyonu veya OIEELISASPSS’ın 1/125 ön–dilüsyonunun pozitif reaksiyon vermesi gerekir.1/10 negatif süt içinde dilüe edilmiş olan OIEELISANSS’ın daima negatif reaksiyon vermesi gerekir.Testin, süt veya peynir altı suyu örneklerinden havuz oluşturulmuş bir hayvan grubu içerisindeki tek bir hayvanda enfeksiyon belirtisini yeterli düzeyde tespit etmeye yeterli olması gerekmektedir.

             4– Sığır brusellozunun teşhisinde ELISA testlerinin kullanım koşulları;

             a) Serum örneklerinde ELISA testleri için yukarıda belirtilen kalibrasyon koşullarının kullanılarak, ELISA’nın diyagnostik sensitivitesinin içinde bulunulan epidemiyolojik durum göz önüne alınarak, RBT veya CFT’ye eşit ya da daha yüksek olması gerekmektedir.

             b) Havuz oluşturulmuş süt örneklerinde ELISA testleri için yukarıda belirtilen kalibrasyon koşullarının kullanılarak, ELISA’nın diyagnostik sensitivitesinin içinde bulunulan epidemiyolojik durumla birlikte ortalama ve beklenen en iyi yetiştirme sistemleri göz önüne alınarak MRT’ye eşit ya da daha yüksek olması gerekmektedir.

             c) ELISA testlerinin sürü statüsünün tespiti ve korunmasında sertifikasyon amacı ile kullanıldığı durumlarda serum örneklerinden havuz oluşturulmasında test sonuçlarının hiçbir şüpheye yer vermeksizin havuzda yer alan münferit hayvan ile ilişkili olduğunu ortaya koyacak şekilde oluşturulması gerekmektedir. Hayvanlardan alınan individüel serum örneklerinde teyit edici testlerin de uygulanması zorunludur.

             ç) ELISA testleri bir çiftlikte sağımdaki süt ineklerinin en az %30’undan toplanan sütlerden hazırlanan bir süt örneğinde kullanılabilir. Bu metot kullanılacağı zaman muayene için alınan örneklerin, kendilerinden süt örneği alınan ilgili hayvanlarla şüpheye yer vermeyecek şekilde bağlantısının kurulabilmesini sağlamak amacı ile gerekli önlemler alınmalıdır. Münferit hayvanlardan alınan serum örneklerinde teyit edici testlerin yapılması zorunludur.

             5– Komplement fiksasyon testi (CFT).

             a) Antigen, fenol–salin (NaCl %0,85 (m/v)) ve veronal bufferda fenol %0,5 % (v/v) (hacim/hacim) içindeki bakteriyel süspansiyondan oluşur. Antijenlerin konsantre durumda dağıtımında kullanılan dilüsyon faktörünün şişe etiketinde belirtilmesi gerekir. Antijen 4 °C’de saklanmalı ve dondurulmamalıdır.

             b) Sığır serumunun inaktivasyonu 56 ila 60 °C arasında, otuz – elli dakika süre ile yapılmalıdır.

             c) Test prosedürü içinde gerçek bir reaksiyon oluşturmak için total hemoliz için gerekli olan minimum dozdan daha yüksek dozda bir komplement dozu kullanılmalıdır.

             ç) Komplement fiksasyon testinin yapılmasında, her defasında aşağıdaki kontrollerin yapılması zorunludur;

             (1) Serumun anti–komplementer etkisi,

             (2) Antijenin kontrolü,

             (3) Sensitize (duyarlı hale gelmiş) alyuvarların kontrolü,

             (4) Komplementin kontrolü,

             (5) Pozitif serum kullanılırken reaksiyon başlangıcındaki sensitivitenin kontrolü,

             (6) Negatif serum kullanılarak reaksiyonun spesifisitesinin kontrolü.

             d) Sonuçların hesaplanması: CFT testte sonuçlar, Ulusal Standart anti Brusella Abortus Serum (USAbS) a göre yapılır. USAbS, 1 ml.’sinde 1000 internasyonal Komplement Fikzasyon Ünitesi (ICFTU) ihtiva eder. Serum International Standart Serum (OIEISS) baz alınarak standardize edilmiştir. CFT inde kullanıldığı zaman alınan titre TUSAbS (OIEISS) olarak verilir. Test edilen serumun titresi ise TTESTSERUM olarak verilir. Test sonucu, test edilen serumun her ml deki  ICFTU ni gösterecek şekilde verilir. Elde edilen titrenin ICFTU nin hesaplanmasında kullanılan Faktör (F) titrenin ICFTU e dönüştürülmesi için kullanılır ve  aşağıdaki formül ile hesaplanır;

             F = 1000 × 1/ T_{USAbS(OIEISS)}

             Test serumunun her ml. sindeki internasyonal CFT ünitesinin (ICFTU_TESTSERUM) hesaplanmasında kullanılan formül; 

             ICFTU_TESTSERUM = F × 1/ T_USAbS

             Örnek: Uygulanan CFT testinde TUSAbS  titresi 1/1280 de pozitif reaksiyon vermiş ve T_TESTSERUM titresi 1/320 de pozitif vermiş bir serumun ICFTU nin hesaplanması;

             F= 1000 × 1/1/1280= 1000 × 0.0078125 = 0.78125

             ICFTU_TESTSERUM = 0.78125 × 320 = 250

             Örnek serum 250  ICFTU ihtiva eder. 20 ICFTU ve üzeri olarak tespit edilen titreler pozitif olarak kabul edilir.

             e) Sonuçların yorumlanması; ml.’de yirmi ya da daha fazla ICFTU içeren bir serum pozitif kabul edilir.

             6– Süt ring testi (MRT).

             a) Antijen fenol salin (NaCl %0,85 (m/v) ve fenol %0,5 (v/v)) içindeki bakteriyel süspansiyonun hematoksilen ile boyanmasıyla meydana gelir. Antijen 4 °C’de saklanır ve dondurulmaz.

             b) Antijen sensitivitesi OIEISS ile bağlantılı olarak antijenin OIEISS’in negatif sütte 1/500 dilüsyonunda pozitif reaksiyon verirken 1/1000 dilüsyonda negatif sonuç verecek şekilde standardize edilmesi gerekmektedir.

             c) Ring testi çiftlikteki her süt yayığı içeriği ya da dökme tankı içeriğini temsil edecek örneklerde yapılmalıdır.

             ç) Süt örnekleri dondurulmamalıdır, ısıtılmamalıdır ya da aşırı şekilde sallanmamalıdır.

             d) Reaksiyon aşağıda sıralanan metotlardan biri kullanılarak gerçekleştirilmelidir;

             (1) 1 ml hacimde bir süt örneğinin en az 25 mm. lik yükseklikte bir süt kolonunda, boyalı standardize antijenlerden birinin ya 0,03 ml ya da 0,05 ml miktarında eklenmesi,

             (2) 2 ml hacimde bir süt örneğinin en az 25 mm. lik yükseklikte bir süt kolonunda, boyalı standardize antijenlerden birinin 0,05 ml miktarında eklenmesi,

             (3) 8 ml. hacminde süte standardize boyalı antijenlerden birinden 0,08 ml miktarında eklenmesi.

             e) Süt ve antijen karışımlarının pozitif ve negatif çalışma standartları ile birlikte 37 °C’de altmış dakika inkübe edilmesi gerekir. Bunu müteakip 4 °C’de  onaltı – yirmidört saatlik ilave bir inkübasyon testin duyarlılığını artırır.

             f) Sonuçların yorumlanması.

             (1) Negatif reaksiyon: renkli süt, renksiz krema,

             (2) Pozitif reaksiyon: Tıpatıp aynı renkte süt ve krema veya renksiz süt ve renkli krema.

             7– Roz bengal pleyt Test (RBT).

             a) Antijen pH of 3,65 ± 0,05’de roz bengal boyası ile boyanmış Brusella antijen dilüenti içinde tamponlu bir bakteriyel süspansiyondan oluşur. Kullanıma hazır olarak dağıtımı yapılacak antijenin 4 °C’de muhafaza edilmesi ve dondurulmaması gerekmektedir.

             b) Antijen hücre konsantrasyonuna bakılmaksızın hazırlanmalı fakat sensitivitesi OIEISS ile bağlantılı olarak antijenin 1/45 serum dilüsyonda pozitif ve 1/55 dilüsyonda negatif sonuç verecek şekilde standardize edilmesi gerekir.

             c) RBT şu şekilde yapılmalıdır;

             (1) Serum (20–30 µl) beyaz zemin (tuğla) ya da emaye pleyt üzerinde eşit hacimde antijen ile karıştırılır ve 2 cm çapında bir zon oluşması beklenir. Karışım ortam sıcaklığında  dört dakika süre ile hafifçe sallanır ve sonra uygun ışık altında aglütinasyon yönünden incelenir.

             (2) Otomatik metot kullanılabilir fakat bunun en az manüel metot kadar duyarlı olması zorunludur.

             (3) Sonuçların yorumlanması; kenarlarda aşırı bir kuruma olmadığı sürece gözle görülebilir herhangi bir reaksiyon pozitif olarak kabul edilir. Pozitif ve negatif çalışma standartları her test serisinde bulunmalıdır.

             8– Serum aglütinasyon testi (SAT).

             a) Antijen fenol salinde (NaCl %0,85 (m/v) ve fenolde %0,5 (v/v)) bakteriyel süspansiyondan oluşur. Formaldehit kullanılmamalıdır. Konsantre durumda dağıtımı söz konusu olan antijenin dilüsyon faktörünün şişe etiketi üzerinde belirtilmesi koşuluyla dağıtımı yapılabilir. Antijen süspansiyonuna final test dilüsyonuna serum aglütinasyon testinde yanıltıcı pozitiflerin oranını düşürmek için 5mm EDTA ilave edilebilir. Daha sonra antijen süspansiyonunda pH yeniden 7,2’ye ayarlanmalıdır.

             b) OIEISS 1 000 uluslararası aglütinasyon birimi içerir.

             c) Antijen hücre konsantrasyonuna bakılmaksızın hazırlanır fakat sensitivitesi OIEISS ile bağlantılı olarak antijenin ya 1/600–1/1000 final serum dilüsyonunda %50 aglütinasyon vereceği şekilde ya da 1/500–1/750 final serum dilüsyonunda %75 aglütinasyon vereceği şekilde standardize edilmelidir. Ayrıca tanımlanmış serum paneli kullanılarak yeni ve önceden standardize edilmiş olan antijen beçlerinin reaktivitelerinin karşılaştırılması önerilmektedir.

             ç) Test ya tüplerde ya da mikropleytlerde yapılır. Antijen ve serum dilüsyonları karışımı 37 °C’de onaltı – yirmidört saat inkübe edilmelidir. Her serum için en az üç dilüsyon hazırlanmalıdır. Şüpheli serum dilüsyonları pozitiflik limiti içinde okunan reaksiyonun median tüpte okunmasını sağlayacak şekilde (ya da mikropleyt metodunda gözde) düzenlenmelidir.

             d) Sonuçların yorumlanması; bir serumun Brusella aglütinasyonunun derecesi her ml.’de IU cinsinden ifade edilir. 30 ya da daha yukarı IU içeren bir serum pozitif olarak kabul edilir.

             C – cELISA testi

             1– Kompetitif enzyme linked immunosorbent assay (cELISA) testi.

             2– cELISA için kullanım şartları;

             a) cELISA ticari amaçlı sertifikalandırmalarda kullanılamaz.

             b) cELISA’nın örneğin indirekt ELISA’dan daha yüksek spesifisiteye sahip olduğu gösterilmiştir. Bu nedenle serolojik testlerin sonuçlarının değerlendirilmesini destekleyici bir metot olarak kullanılabilir.

             3– Test prosedürü, OIE Diyagnostik Testler ve Aşılarla İlgili Standartlar El Kitabına uygun olarak gerçekleştirilecektir.

             Ç – Ulusal Referans laboratuvarları

             1– Ulusal Referans laboratuarları.

             2– Ulusal Referans laboratuvarlarının görev ve sorumlulukları;

             a) Ülkede kullanılan test metodunun güvenilirliğini gösteren geçerlilik çalışmalarının sonuçlarının onaylanması,

             b) Kullanılan ELISA kitlerinde havuz oluşturulacak maksimum örnek sayısının tespiti,

             c) Standart ikincil ulusal referans serumlarının (çalışma standartları) uluslararası birincil standart seruma karşı kalibre edilmesi,

             ç) Ülkede kullanılan antijenlerin ve ELISA kit beçlerinin kalite kontrolleridir.

Ek–4

RESMİ BRUSELLOZ (B. melitensis) TESTLERİ

             A –Testler

             1– Roz Bengal Testi;

             a) Rose Bengal testi koyun veya keçi sürülerinde resmi olarak brusellozdan ari ve brusellozdan arilik statüsünün elde edilmesinde izleme (screening) testi olarak kullanılabilir. Testin uygulanması Ek–3’e göre yapılır.

             b) Roz Bengal testini uygularken, işletmedeki hayvanlardan %5’ten fazlası pozitif reaksiyon verirse, işletmedeki her hayvan üzerinde komplement fiksasyon metodu ile bir test daha uygulanır.

             2– Komplement–fiksasyon testi;

             a) Komplement–fiksasyon testi bütün münferit hayvan testlerinde kullanılmalıdır.

             b) Komplement–fiksasyon testi koyun veya keçi işletmelerinde işletmenin resmi olarak brusellozdan  ari veya brusellozdan ari statüsü elde edilmesinde kullanılabilir.

             c) 20 ya da daha yüksek CFT birim/ml. içeren serumlar pozitif olarak kabul edilir.

             3– Kullanılan antijenler ulusal referans laboratuvarı tarafından onaylanmalıdır. İkinci uluslararası standart anti brusella abortus serumuna karşı standardize edilmelidir.     

             4– Çalışma serumu standart serumla standardize edilmelidir ve Merkez Veteriner Laboratuvarı, Weybridge, Surrey, İngiltere tarafından hazırlanan ikinci uluslararası standart anti brusella abortus serumuna uyumlu olmalıdır.

             B – Bulaşıcı Epididimitis (Brusella ovis) Resmi Testi

             1– Komplement–fiksing testi;

             a) Kullanılan spesifik antijen ulusal referans laboratuvarı tarafından onaylanmalı ve uluslararası standart anti brusella ovis serumuna karşı standardize edilmelidir.

             b) Çalışma serumu Merkez Veteriner Laboratuvarı, Weybridge, Surrey, İngiltere tarafından hazırlanan uluslararası standart anti brusella ovis serumu ile standardize edilmelidir. Her ml. için 50 ya da daha yüksek uluslararası birim içeren bir serum pozitif olarak kabul edilir.