Saib Gurban oglu Gulahmadov · Batjargal Batdorj · Mich`ele Dalgalarrondo

faecalis R69 [
22
].
The detection of bacteriocins and other antimicrobial
substances from LAB has involved the use of variety of
methodologies with both agar [
23
–
25
] and broth cultures
[
26
,
27
]. Garver and Muriana [
28
] have demonstrated that
large numbers of LAB isolates from food sources need
to be screened to identify bacteriocin producers because
the detection rate of positive strains on agar media can be
as low as 0.2%. Similar results have been observed with
detection of bacteriocin-producing Coryneform [
29
] and
Enterococcus and Staphylococcus [
30
] bacteria from red
smear cheese.
The aim of this study was to progress in identification
of bacteriocin-like inhibitory substance (BLIS)-producing
LAB isolated from native Azerbaijani cheeses and to par-
tially characterize their inhibitory activities. Considering
the important diversity of climates and ecological niches
so multiple in Azerbaijan as well as immemorial pastoral
traditions of many ethnic groups transiting or dwelling in
this region, which forms a geographic and natural interface
between Europe and Asia, the diversity of LAB can be
expected to be important – hence presenting potentially
great interest.
Materials and methods
Bacterial strains, media, culture conditions,
and chemicals
Preliminary production of substances with antimicrobial
activity by isolated LAB was screened by the antagonism
method using various indicator strains. The bacterial strains
used in this study as indicator microorganisms are listed in
Table
1
. All media were supplied by Difco (Detroit, MI,
USA). Other chemicals were provided by Sigma-Aldrich
(St. Louis, MO, USA).
Table 1
Bacterial strains used in this study
Strain
Origin
Media
Lactobacillus bulgaricus 340
Rhodia Food. Tex. Fr
MRS
Listeria innocua F
CIP 046
BH
Escherichia coli HB 101
BAS
LB
Staphylococcus aureus
ENITIAA
BH
Saccharomyces cerevisiae
ENITIAA
YPD
Candida pseudotropicalis
ENITIAA
YPD
LAB was propagated in MRS broth at 30
◦
C. Listeria in-
nocua and Staphylococcus aureus were propagated in BH
medium at 37
◦
C. Other indicator strains were grown in
LB medium (Escherichia coli) and YPD medium (Saccha-
romyces cerevisiae, Candida pseudotropicalis).
Before use, the strains were propagated twice in broth
from 18 to 24 h.
Isolation of LAB with antimicrobial activities
Two different kinds of cheeses (Motal and Brunza, origi-
nally made of sheep’s milk alone, or combined with goat’s
milk) were used. Isolation was performed by direct plat-
ing method [
31
]. Samples from each kind of Azerbaijani
cheeses were homogenized in saline solution then 10-fold
serially diluted with saline solution. Aliquotes (1 mL) were
plated in soft MRS agar (0.8%, w/v) medium and incubated
at 37
◦
C for 48 h. Multiple plates of serial dilutions (three
to five plates) were overlaid with indicator strain (L. bul-
garicus 340) inoculated (5%, v/v) into 10 mL of soft agar
MRS medium (0.8% agar) and incubated for another 24 h
period at 37
◦
C. Inhibition was scored positive in presence
of a detectable clearing zone around the colony of the pro-
ducer strain. Positive colonies were randomly selected and
removed using sterile Pasteur pipette. The agar plug from
Pasteur pipette was inoculated in MRS liquid medium for
24 h at 37
◦
C. LAB isolated from cheese were stored at
− 80
◦
C in MRS broth containing 20% glycerol.
The antimicrobial activity of LAB was detected by well
diffusion assay [
25
] using 20 mL soft agar medium (0.8%
agar) containing 100
µL indicator strain. Thereafter, wells
(9 mm in diameter) were cut into the agar and 100
µL of
the cell-free supernatant (centrifugation at 10,000
× g for
15 min at 4
◦
C) of the potential producer strains was placed
into each well. In order to eliminate the inhibitory effect
of lactic acid on the test organisms, the supernatants were
adjusted to pH 6.5 with 1 N NaOH followed by filtration
through a 0.22
µm pore size filter. Prior to incubation for
24 h at the optimal growth temperature for the indicator
strains, plates were refrigerated (4
◦
C) for 4 h to allow the
radial diffusion of the compounds contained in the super-
natant. A clear zone of inhibition of at least 2 mm diameter
was recorded as positive.
Identification of lactobacilli
Unidentified Gram-positive and catalase-negative rods
showing positive results after the well diffusion assay
were subjected to identification by API 50 CHL System
(bioMerieux, Lyon, France). The API test was preceded by
assays, which considered growth at 10, 30, 37, and 45
◦
C.
Verification of the protein nature of the active
substance
The protein nature of the antimicrobial agents produced by
lactobacilli isolated from Azerbaijani cheeses was checked

---

by enzyme treatment with the following enzymes (Sigma):
pronase (11.4 U/mg), proteinase K (45 U/mg), and trypsin
(10.6 U/mg) at final concentration of 1 mg/mL in 20 mM
phosphate buffer (pH 7.0). The supernatants were incu-
bated with these enzymes at 37
◦
C for 2 h. Each solu-
tion was further tested against Lactobacillus bulgaricus
340 in the presence of negative controls such as the initial
antimicrobial supernatant and the buffered enzyme solu-
tions of each enzyme. The supernatants were examined for
their sensitivity to lipolytic and amylolytic enzymes, by li-
pase (E.C. 3.1.1.3) type VII from Candida rugosa (Sigma,
50 U/mg) and
α-amylase (E.C. 3.2.1.1.) type II-A from
Bacillus species (Sigma, 15 U/mg), respectively, at a final
concentration of 1 mg/mL in phosphate buffer (pH 7.0). Re-
maining activity was determined by a well diffusion assay.
Untreated samples were used as controls.
pH and heat stability of the BLIS
Bacteriocin-like inhibitory substance (BLIS)-containing
cell-free supernatants were adjusted to different pH val-
ues, ranging from 2.0 to 12.0, with 5 N HCl or 1 N NaOH.
After 1 h of incubation at 37
◦
C, the pH was adjusted to 6.5
and the residual activity was tested as described earlier.
Sensitivity to heat was tested by heating cell-free super-
natant samples to different temperatures and testing the
residual activity after 10, 15, 30, and 60 min by the agar
diffusion assay.
Kinetics of BLIS production
In order to determinate the time course of BLIS production
10 mL of an overnight culture of LAB strains was inocu-
lated into 100 mL of MRS broth then incubated at 30 and
37
◦
C under non-regulated pH condition. At appropriate in-
tervals the growth of cells was monitored by measuring the
turbidity (optical density at 620 nm) and pH. Samples were
removed at 2-h intervals and the neutralized cell-free su-
pernatants were tested for antimicrobial activity measured
as diameter of clear zone.
Results
Screening of LAB from cheeses for antimicrobial
compound production
Two kinds of cheeses (Motal and Brunza) were initially
screened for antimicrobial compound production against