Saib Gurban oglu Gulahmadov · Batjargal Batdorj · Mich`ele Dalgalarrondo

L. bulgaricus 340, as indicator strain, by means of the di-
rect plating method (Fig.
1
and Table
2
). These two kinds
of cheeses used for their content in LAB were produced at
specific ecological localities of Azerbaijan. In this step, the
possible inhibitory effect of the organic acids and hydro-
gen peroxide was not excluded. The cell-free supernatants
from the active strains were treated with catalase, neutral-
ized and tested by well diffusion assay against L. bulgaricus
Table 2
Activity of cell-free culture supernatant of LAB strains
isolated from Azerbaijani cheeses against Lactobacillus bulgaricus
340 after different treatments, determined by well diffusion assay
Treatment
Origin
Strain
pH 6.5
Catalase
Brunza
BN ATS 5w
+
+
BN ATS 7w
+
+
BN ATS 8w
+
+
Motal
FAZ 16m
+
+
+ : Activity
Fig. 1 Determination of antimicrobial activity of the selected strains
against L. bulgaricus 340 by direct plating method
340. Four unidentified LAB strains (BN ATS 5w, BN ATS
7w, BN ATS 8w, and FAZ 16m) were found to maintain an
antimicrobial activity against indicator, showing a measur-
able clear zone around the well.
Identification
The four LAB strains, not identified previously, were sub-
jected to phenotypic identification (Table
3
). The strains
BN ATS 5w, BN ATS 7w, BN ATS 8w, and FAZ 16m are
catalase-negative, Gram-positive, rod-shaped organisms.
Most of these characteristics suggested that these isolates
could belong to the genus Lactobacillus. The carbohydrate
fermentation pattern of the strains determined by API 50
CHL System (data not shown) and the properties listed in
Table
3
, suggested that three of these strains (BN ATS 5w,
BN ATS 7w, and BN ATS 8w) could be identified as Lac-
tobacillus paracasei subsp. paracasei and one (strain FAZ
16m) as Lactobacillus rhamnosus.
Antimicrobial activity spectrum
The test microorganisms used for identification of an-
timicrobial activities of selected strains are presented in

---

Table 3
Properties tested for the identification of active LAB strains obtained from Azerbaijani cheeses
Temperature of growth
Strains
Origin
Gram
Shape
Catalase test Acid production (pH)
10
◦
C
30
◦
C
37
◦
C
45
◦
C
BN ATS 5w
Brunza
+
Bacilli
−
4.03
+
+
+
+
BN ATS 7w
+
Bacilli
−
4.02
+
+
+
+
BN ATS 8w
+
Bacilli
−
4.03
+
+
+
+
FAZ 16m
Motal
+
Bacilli
−
4.12
+
+
+
+
Table 4
Antimicrobial
activity
a
spectrum of the
cell-free culture supernatant of
the selected strains
Strains studied
Indicator strains
BN ATS 5w
BN ATS 7w
BN ATS 8w
FAZ 16m
Lactobacillus bulgaricus 340
+ +
+ +
+ +
+ +
Escherichia coli HB 101
−
−
+
+ +
Listeria innocua
−
−
−
−
Staphylococcus aureus Cip 9973
+ +
−
+
+ +
Candida pseudotropicalis
+ + +
+ +
−
−
Saccharomyces cerevisiae
+ +
+
+ +
+ + +
a
Antimicrobial activity was determined by the well-diffusion assays described in Materials and methods
section
− , no inhibition; + , inhibition zone <3 mm; + + , inhibition zone 3–6 mm; + + + , inhibition zone
>6 mm
Table
1
. They are various Gram-positive and Gram-
negative bacteria (including other LAB) and fungi. The
results of antimicrobial activity spectrum tests of the
active isolated strains are shown in Table
4
and in Fig.
2
. L. bulgaricus 340 and S. cerevisiae were inhibited by
the four isolated strains. Antibacterial activity against E.
coli HB 101 was detected in two strains (L. paracasei
BN ATS 8w and L. rhamnosus FAZ 16m). Three studied
strains (L. paracasei BN ATS 5w, L. paracasei BN ATS
8w, and L. rhamnosus FAZ 16m) showed inhibitory effect
on S. aureus Cip 9973. The inhibition of another yeast
– C. pseudotropicalis was detected only when using the
two identified L. paracasei species (BN ATS 5w and BN
ATS 7w). Culture of L. innocua was insensitive to the
antimicrobial substances of all the studied strains.
Effect of enzymes, pH, and heat treatments
The activity of the inhibitory agents produced by the
selected strains was tested by the well diffusion method.
Fig. 2 Antimicrobial activity
spectrum of BN ATS 5w, BN
ATS 7w, BN ATS 8w, and FAZ
16m against S. Aureus, C.
pseudotropicalis, E. coli, L.
bulgaricus, L. innocua, and S.
cerevisiae determined by well
diffusion assay. BN ATS 5w
strain: 1, cell culture; 2,
supernatant. BNATS 7w strain:
3, cell culture; 4, supernatant.
BN ATS 8w strain: 5, cell
culture; 6, supernatant. FAZ
16m strain: 7, cell culture; 8,
supernatant

---

Table 5
Effect of enzymes,
pH, and temperature on
inhibitors of the cell-free
supernatant of the selected
strains determined by well
diffusion assay
Treatments
BN ATS 5w
BN ATS 7w
BN ATS 8w
FAZ 16m
Enzyme
Pronase E
−
−
−
−
Proteinase K
−
−
−
−
Trypsin
+
+
+
−
α-Amylase
−
−
−
+
Lipase
±
±
±
±
pH
2
±
±
−
−
3
+
+
+
+
5
+
+
+
+
7
+
+
+
+
9
+
+
+
+
11
+
+
+
+
12
−
−
−
−
Temperature
100
◦
C 10 min
+
+
+
+
100
◦
C 30 min
±
±
−
−
100
◦
C 60 min
−
−
−
−
121
◦
C 15 min
−
−
−
−
+ , activity; − , no activity; ± ,
activity decreased as compared
to absence of treatment
Activity was preserved under conditions that eliminate
the possible effect of organic acids by adjusting the pH
of cell-free supernatant to 6.5, and of hydrogen peroxide
by catalase treatment. The effect of various enzymes on
the inhibitory agents was studied (Table
5
). Complete
inactivation or significant reduction in antibacterial activity
of the agents produced by all the selected strains was
observed after treatment of cell-free supernatants with
pronase E and proteinase K but not with trypsin (except
for L. rhamnosus FAZ 16m), which indicated the protein
nature of the active agents (Table
5
). As inhibitory protein
compounds of closely related bacteria can be included
in the category of the bacteriocins [
32
,
33
] and because