Transgen o’simliklar yaratish texnologiyasi. Kallus to’qimasi

T-DNK vektor vazifasini bajarishi mumkin
T-DNK o'simlik genomiga begona genlarni kiritish uchun ideal vektor bo'la oladi.
Sababi T-DNKda 2ta ajoyib hususiyat bor:

• 
  agrobakteriya ikki pallali o'simliklarni deyarli barchasini transformatsiyalaydi (hattoki boshoqli ekinlarni ham);
  
• 
  T-DNK o'simlik genomiga joylashib oladi. Oqibatda T-DNK genlari o'simlikning keyingi avlodlariga dominant belgi sifatida Mendel' qonunlari bo'yicha irsiylanaveradi.
  

Transgen o'simlik yaratish uchun Ti-plazmidaning T-DNK qismiga kerakli genlar kiritilsa bas, qolgan barcha ishni bakteriyani o'zi bajaradi. Biroq recombinant DNK olish uchun Ti-plazmidaning o'lchami juda katta. Ushbu muammoni hal qilish maqsadida quyidagi rasmda ko'rsatilgan tehnologiya ishlab chiqilgan.

15-rasm. Ti-plazmidadan vektor sifatida foydalanish. Dastlab Ti-plazmidadan restriktazalar yordamida T-DNK kesib olinadi. Kesib olingan T-DNK E. coli bakteriyasining pBR322 plazmidasiga kiritiladi. pBR322 plazmidasidagi T-DNKga o'simlik geni joylashtiriladi. Gibrid plazmida hosil bo'ladi. Bu plazmida agrobakteriyaga qayta kiritiladi. Agrobakteriya esa o'simlikka yuboriladi.
Dastlab Ti-plazmidaning T-segmenti restriktazalar bilan kesiladi. T-segmentni ko'paytirish uchun Escherichia coli bakteriyasinng pBR322 plazmidasiga kiritiladi. pBR322 replikatsiyalanganda undagi T-segmentni soni ham ko'payadi. Bu jarayon klonlash deyiladi. Tarkibida T-segment saqlagan pBR322 plazmidasi etarlicha klonlangandan keyin bakteriyadan ajratiladi. Ajratilgan gibrid plazmidaga o'simlik geni joylashtiriladi va yana klonlash uchun Escherichia coli bakteriyasiga qayta kiritiladi. Klonlangan plazmidalar Escherichia coli bakteriyasidan ajratiladi va agrobakteriya sitoplazmasiga kiritiladi. So'ngra agrobakteriya o'simlikka yuboriladi. Agrobakteriyadagi gibrid plazmidaning T-segmenti o'simlik genomiga qo'shilib ketadi. Transgen o'simlik ana shunday tehnologiya asosida yaratiladi.
Yuqorida keltirilgan tehnologiyani biroz soddalashtirish mumkin. Buning uchun binar vektor sistemalardan foydalaniladi. Bunda agrobakteriya hujayrasida ikki hil modifikatsiyalangan Ti-plazmida bo'lishi kerak. Plazmidalarning birida faqat vir-zona bo'ladi. vir-zona T-DNK kesilishi uchun javobgar. Bunday plazmidalar yordamchi plazmidalar deyiladi.
Ikkinchi plazmidada esa faqat o'simlik geni kiritilgan T-DNK bo'ladi.
Ikkala plazmida bitta hujayraga joylashtiriladi. Agrobakteriya ikki hil plazmidasi bilan birga o'simlikka yuboriladi. Yordamchi plazmidaning vir-zonasi ikkinchi plazmidaning T-segmentini kesadi. Yuqorida ta'kidlanganidek, T-segment o'simlik genomiga birikadi.
Qisqa qilib aytganda, Ti-plazmida asosidagi ideal vektor sistema quyidagi elementlar va hossalarga ega bo'lishi zarur:

1. 
   o'simlik genomiga barqaror qo'shilishi uchun barcha kerakli signallar, genlarning ekpressiya sistemasi (o'simlik polimerazalari «taniydigan» promotor), transformatsiyalangan hujayralarni selektsiyasi (saralash) uchun marker;
   
2. 
   vektor sistemada onkogenlar bo'lmasligi kerak. Ular o'simlik hujayralarini differentsiyallanishini to'htadi.
   

Onkogenlarni yo'qotish uchun transpozonli mutagenez (transpozon - ko'chib yuruvchi genetik element) usuli qo'llaniladi. T-DNKga transpozonlar kiritilsa, o'simlikda shish hosil qiladigan genlar (iaaM, iaaH, ipt) «o'chiriladi». Transpozonlar T-DNKni o'simlikka o'tishiga halaqit qilmaydi. Transpozonli mutagenezda Tn5, Tn7 bakterial transpozonlardan foydalaniladi.
Ti-plazmidani modifikatsiyalashda restriktsiya saytlariga (restriktazalar kesadigan uchastkalar) ham e'tibor berish kerak. Modifikatsiyada EcoR1, Hind III, BamH1 va boshqa restriktazalar ishlatiladi. Ba'zida ma'lum bir saytning 18-20 uchastkasidan taniydigan turli hil restriktazalar bo'ladi. Shuning uchun bunday uchastkalar polilinkerlar deb ataladi.
Bundan tashqari, vektor molekulalarini konstruktsiyalashda promotorlarga ham e'tibor berish kerak. Promotor quyidagi hossalarga ega bo'lishi kerak:

• 
  faol ekspressiya;
  
• 
  to'qima va organspetsifik ekspressiya;
  
• 
  boshqarilish imkoniyati.
  

Ayrim genlar yuqori temperatura ta'sirida faollanadi. Bunday genlar boshqariladigan promotorlarga misol bo'ladi. Ayrim genlar zahira oqsillari (masalan, boshoqli o'simliklarda uchraydigan zein oqsili) sintezini nazorat qiladi. Ular to'qima spetsifik ekspressiyaga misol bo'ladi.
O'simliklar gen muhandisligida ko'p ishlatiladigan promotor - CAMV (cauliflower mosaic virus – gulkaram mozaikasi virusi) promotori. CAMV promotoriga ulangan genlar o'simlikning barcha to'qimalarida faol ekpressiyalanadi.
Va nihoyat vektorlarda markerlar ham bo'lishi zarur. Chunki transgen o'simliklar marker genlar yordamida saralanadi. Marker genlar reporter genlar ham deyiladi. Marker genlar soni anchagina. Misol uchun, luxA va luxB genlari. Ular tunda yonib turadigan hasharotlar DNKsidan ajratilgan. luxA va luxB genlari lyutsiferaza fermenti sintezini boshqaradi. Lyutsiferaza oksidlangan lyutsefirin pigmentini lyutsefiringa o'tish reaktsiyasini katalizlaydi. Tungi hasharotlarning yonib turishiga luytsefirin pigmenti sababchidir. luxA va luxB marker genlarini saqlagan transgen o'simlikni boshqalaridan ajratib olish oson. Chunki ular, yuqorda aytganimizdek, chiroq shu'lasi kabi yonib turadi.
Ohirgi paytlarda pgfp markeri ham keng ishlatilmoqda. Bu gen GFP-oqsili (green fluorescent protein) sintezini nazorat qiladi. U Acquorea victoria meduzasining DNKsidan olingan. Tanasida pgfp markeri saqlagan transgen o'simlikka ul'trabinafsha nur tushurilsa, u yashil rang berib tovlanadi.
T-DNK orqali o'simlik hujayralarini transformatsiyalashning an'anaviy usuli - mahsus jarohatlangan yosh o'simlik novdasiga tarkibida Ti-plazmida mavjud agrobakteriyani kiritish. Hozirda transgen o'simlik olishning bir necha hil usullari ishlab chiqilgan. Hattoki mahsus «Shotgun» qurilmasi yaratilgan. DNK molekulalari vol'fram sharchalar bilan o'raladi va «Shotgun» qurilmasida o'simlik tanasiga miltiqdan o'q otish kabi otiladi.