Glutathione peroxidase, superoxide dismutase

PENDAHULUAN
Radikal bebas dan berbagai spesies oksigen reaktif (SOR) yang dihasilkan oleh proses metabolik normal maupun yang berasal dari sumber eksternal lain dapat menyebabkan kerusakan pada semua jenis makromolekul selular, meliputi protein, karbohidrat, lipid, dan asam nukleat.¹ Secara alami tubuh manusia mampu menetralkan radikal bebas melalui mekanisme enzimatik misalnya glutathione peroxidase, superoxide dismutase dan katalase maupun melalui aktivitas antioksidan berbagai senyawa dalam cairan tubuh, misalnya glutathione, ubiquinol, dan asam urat. Antioksidan akan mengambil kelebihan elektron, memodifikasi SOR, sehingga reaktivitasnya berkurang dan dapat mencegah kerusakan komponen selular yang fatal.^1,2 Dalam keadaan patologis atau kondisi lain yang menghasilkan banyak radikal bebas, sistem pertahanan alami tersedia di atas tidak mencukupi dan dibutuhkan suplementasi antioksidan dari luar. Dari berbagai suplemen antioksidan nonenzimatik, vitamin C, vitamin E, beta karoten, selenium, dan berbagai senyawa lain telah dibuktikan bersifat sebagai antioksidan kuat.^3,4

Akhir-akhir ini, di Indonesia beredar suplemen antioksidan yang mengandung likopen dan leukoselekfitosom yang terbukti dapat menghambat proses oksidatif yang dihasilkan oleh proses sonolisis, pajanan ultraviolet (UV)-B, dan UV-A.^5,6 Diketahui bahwa UVA dan UVB hanya akan mampu menghasilkan radikal bebas apabila dapat mencapai targetnya disertai tersedianya senyawa yang bersifat fotosensitiser.⁷ Dalam kehidupan sehari-hari, stres oksidatif akibat radikal hidroksil yang terjadi akibat terurainya hidrogen peroksida dianggap jauh lebih berbahaya dibandingkan stres oksidatif karena SOR lainnya². Sejauh ini potensi likopen dan leukoselekfitosom terhadap aktivitas radikal hidroksil belum pernah dilakukan.

Dalam makalah ini dilaporkan aktivitas antioksidan senyawa likopen dan leukoselekfitosom terhadap kerusakan membran eritosit akibat stres oksidatif oleh H₂O_2.

Metode penelitian
Desain penelitian
Open Randomized Clinical Trial (RCT) dilakukan untuk membandingkan aktivitas antioksidan antara kombinasi likopen dan leukoselekfitosom, kombinasi beta karoten, vitamin C, vitamin E, dan selenium, serta plasebo.
Subyek penelitian dan perlakuan
Dua puluh tujuh relawan sehat yang memenuhi kriteria penelitian diacak, dibagi menjadi 3 kelompok: Kelompok A mendapat suplementasi likopen 2,5 mg + leukoselekfitosom 25 mg 3 tablet/hari, kelompok B mendapat beta karoten 6 mg + vitamin C 250 mg + vitamin E 200 mg + selenium 30 mcg 1 tablet/hari, dan kelompok C mendapat plasebo selama 30 hari 2 tablet/hari. Kriteria inklusi adalah: sehat, usia 20-50 tahun, tidak merokok, bersedia mengikuti tata cara penelitian, serta mengisi blanko persetujuan. Kriteria eksklusi: mengkonsumsi suplemen vitamin dalam 2 minggu sebelum penelitian. Setelah waktu suplementasi selesai, darah relawan diambil dan diuji secara invitro dengan H₂O₂ tanpa oksidator.
Cara penelitian
Sampel darah diambil dan dimasukkan ke dalam tabung venoject yang berisi EDTA, lalu dipindahkan ke ependorf dan dilakukan sentrifugasi dengan kecepatan 2100 rpm selama 10 menit. Kemudian supernatan dibuang, endapan eritrosit dicuci 3 kali dengan melakukan resuspensi 10 l pellet eritrosit dalam 990 l TCM buffer (dalam 1 liter berisi: Tris 3 g; KCl 0,3 g; CaCl₂.2H₂O 1,15 g; MgCl₂.6H₂O 0,2 g) yang mengandung 0,03% human albumin yang telah ditempatkan pada sumur-sumur microplate steril, diinkubasi dalam gelap selama 10 menit, kemudian dalam inkubator bersuhu 37ºC dan CO₂ 5% (Galaxy S, RS Biotech). Selanjutnya 10 l campuran tersebut diganti dengan 10 l 500 mM H₂O₂ dan diinkubasi dalam gelap selama 10 menit, kemudian disentrifugasi 10 menit dengan kecepatan 2600 rpm. Hemolisis diukur dengan mengukur densitas optis 500 l supernatan yang dicampur dengan 4,5 ml larutan Drabkin dalam tabung gelap, 2 ml larutan dipindahkan dalam cuvette dan dibaca dengan alat spektrofotometer 546 nm.
Analisis statistik
Perbedaan rerata densitas optis (DO) antara 3 kelompok perlakuan diuji dengan uji Kruskall-Wallis, sedangkan perbandingan DO antara H₂O₂ dan tanpa H₂O₂ pada kelompok plasebo diuji dengan Uji Mann-Whitney.
Hasil
Setiap kelompok perlakuan terdiri atas 9 orang relawan yang masing-masing mempunyai ciri sebagai berikut: kelompok A terdiri atas 2 pria dan 7 wanita dengan rerata usia 38,33  7,97 tahun; kelompok B terdiri atas 3 pria dan 6 wanita dengan rerata usia 32,89  7,08 tahun; sedangkan kelompok C terdiri atas 3 pria dan 6 wanita dengan rerata usia 40,11  10,58 tahun.
Grafik 1. Perbandingan rerata DO antara H₂O₂ dan tanpa H₂O₂ pada kelompok plasebo

Pada grafik 1 tampak bahwa rerata DO antara eritrosit yang mendapat H₂O₂ dan yang tidak mendapat H₂O₂, berbeda secara bermakna (p<0,05)

Grafik 2. Perbandingan rerata DO pada tiap kelompok perlakuan

Ket: * perbandingan rerata densitas optik kelompok A, B dan C

** perbandingan rerata densitas optik kelompok A dan B
Dari grafik 2 terlihat perbedaan yang bermakna rerata DO supernatan antara kelompok A dan B terhadap plasebo (p<0,05)) dan tidak didapatkan perbedaan yang bermakna antara rerata DO kelompok A dan kelompok B (p>0,05)


DISKUSI
Eritrosit sering digunakan untuk mempelajari kerusakan oksidatif membran. Eritrosit peka terhadap peroksidasi lipid karena terdiri atas polyunsaturated lipid, kaya suplai oksigen dan adanya logam transisi.⁸ Peroksidasi membran eritrosit dan hemolisis dapat diinduksi oleh beberapa bahan, misalnya H₂O_2, dialuric acid, xanthin oxidase, dan hiperoksida organik. Kerusakan oksidatif pada membran eritrosit akibat aktivitas radikal bebas dapat menyebabkan kerapuhan membran dan terjadinya hemolisis.^8,9,10 Pada grafik 1 tampak bahwa konsentrasi dan banyaknya H₂O₂ yang diberikan terbukti dapat menimbulkan lisis pada membran sel eritrosit. Hal ini ditandai dengan semakin tingginya kadar hemoglobin supernatan pada kelompok dengan H₂O₂ dibandingkan kelompok tanpa H₂O₂.

Suplementasi antioksidan nonenzimatik, misalnya vitamin C, vitamin E, beta karoten, selenium, dan berbagai senyawa lain secara tunggal maupun dalam bentuk kombinasi telah dibuktikan bersifat sebagai antioksidan kuat.^3,4 Hal serupa dijumpai pada penelitian ini. Pada grafik 2 tampak bahwa pemberian kombinasi beta karoten, vitamin C, vitamin E dan selenium melindungi sel terhadap kemungkinan lisis akibat hidrogen peroksida. Semakin tinggi tingkat perlindungan terhadap membran sel, lisis yang terjadi semakin sedikit, sehingga kadar hemoglobin pada supernatan semakin rendah yang ditunjukkan dengan rendahnya DO pada spektrofotometer. Hal serupa dijumpai pada kelompok yang mendapat suplemen kombinasi likopen dan leukoselekfitosom. Pada gambar tersebut tampak juga bahwa rerata DO pada kombinasi likopen dan leukoselekfitosom dengan kombinasi beta karoten, vitamin C, vitamin E dan selenium tidak berbeda secara bermakna (p>0,05).

Di alam bebas, karotenoid utama terdiri atas beta karoten yang banyak ditemukan pada wortel dan likopen yang ditemukan pada tomat¹¹. Selain terdapat pada tomat dan produk olahannya, likopen juga terdapat pada pink grapefruit, pepaya, dan buah apricot¹². Likopen termasuk karotenoid yang terdapat dalam jaringan tubuh, termasuk darah, dengan jumlah  50% karotenoid total¹³. Leukoselekfitosom merupakan penggabungan kombinasi lekoselek (grape seed procyanidin) dengan soy phospholipids dengan tujuan memperbaiki bioavailabilitas oral leukoselek yang umumnya rendah dan tidak pasti. Penelitian sebelumnya menunjukkan bahwa procyanidins dari ekstrak biji anggur dapat mencegah hemolisis eritrosit mencit akibat pajanan UV-B.⁵ Efek antioksidan kombinasi likopen dan leukoselekfitosom telah diteliti secara in vitro. Kedua komponen ini bekerjasama pada konsentrasi mikromolar menghadapi oksidasi berbagai komponen, misalnya metil-linoleat micelles dan fosfatidilkolin liposom yang terjadi pada proses sonolisis. Kekuatan antioksidan dalam biji anggur (leucoselect) dinyatakan 20-50 kali lebih baik bila dibandingkan vitamin C, vitamin E dan beta karoten^13,14. Pada penelitian ini aktivitas antioksidan kombinasi likopen dan lekoselektifitosom terbukti setara dengan gabungan beta karoten, vitamin C, vitamin E dan selenium.

KESIMPULAN DAN SARAN
Pada penelitian ini kombinasi likopen dan leukoselekfitosom menunjukkan aktivitas antioksidan yang setara dengan kombinasi beta karoten, vitamin C, vitamin E dan selenium. Diperlukan penelitian lebih lanjut dalam jumlah sampel yang lebih besar untuk mengetahui aktivitas antioksidan kombinasi likopen dan leukoselekfitosom pada kerusakan membran eritrosit akibat stres oksidatif oleh H₂O₂.

UCAPAN TERIMA KASIH
Obat antioksidan kombinasi likopen dan leukoselekfitosom pada penelitian ini disediakan oleh PT SOHO Industry Farmacy. Obat antioksidan kombinasi betakaroten, vitamin C, vitamin E dan Selenium disediakan oleh PT Ferron.
DAFTAR PUSTAKA

1. 
   Karakaya S, El SN, Tas AA. Antioxidant activity of some foods containing phenoliccompounds. Int J of Food Scien and Nutri. 2001; 52: 501-8
   
2. 
   Al-Omar M, Bedham C, Alsarra AA. Pathological roles of reactive oxygen species and their defence mechanism. Saudi Pharmaceutical Journal. 2004; 12: 1-18
   
3. 
   Konig D, Berg A. Exercise and oxidative stress: is there a need for additional antioxidants. Osterreichisches Jour Fur Sportmedizin, 2002; 3: 6-13
   
4. 
   Chan AC, Chow CK, Chiu D. Interaction of antioxidants and their implication in genetic anemia. PS Exp Biol Med. 1999; 222: 274-80
   
5. 
   Carini M, Aldini G, Bombardelli E, Morazzoni P, Maffei FR. UVB-induced hemolysis of rat erythrocytes: protective effect of procyanidins from grape seeds. Life Sci. 2000; 67 (15): 1799814
   
6. 
   Offord EA, Gautier JC, Avanti O, Scaletta C, Runge F, Kramer K, Applegate LA. Photoprotective potential of lycopene, beta-carotene, vitamin E, vitamin C and carnosic acid in UVA-irradiated human skin fibroblasts. Free Radic Biol Med. 2002 ;32(12):1293-303(abstrak).
   
7. 
   Konig BE, Placzek M, Przybilla B. Phototoxic lysis of erythrocytes from humans is reduced after oral intake of ascorbic acid and d-alfa-tocopherol. Photodermatol Photoimmunol Photomed. 1997; 13: 173-7
   
8. 
   Zhu QY, Holt RR, Lazarus, SA, Orozco TJ, Keen CL. Inhibitory effect of cocoa flavanols and procyanidin oligomers on free radical-induced erythrocyte hemolysis. Exp Biol Med. 2002; 227 (5): 321-9
   
9. 
   May JM. Ascorbate function and metabolism in the human erythrocyte. Frontiers in Bioscience. 1998; 2: 1-10
   
10. 
    Davis, KJA, Goldberg AL. Oxygen radicals stimulate intracellular proteolysis and lipid peroxidation by independent mechanism in erythrocyte. J Biol Chemis. 1998; 262 (17): 8220-5
    
11. 
    F’guyer S, Afaq F, Mukhtar H. Photochemoprevention of skin cancer by botanical agents. Photodermatol Photoimmunol Photomed. 2003; 19: 56-72
    
12. 
    Khachik F, Carvalho L, Bernstein PS, Muir GJ, Da-You Zhao, Katz NB. Chemistry, distribution, and metabolism of tomato carotenoids and their impact on human health. Exp Biol Med. 2002; 227: 845-851
    
13. 
    Lea Y. Legres ® (leucoselect phytosome 25 mg, lycopene 2,5 mg), The most powerfull antioxidant. Dalam makalah Simposium Peranan fitofarmaka di bidang dermatologi. 2004: 1-15
    
14. 
    Wells KR. Grape seed extract. Gale Encyclopedia of Alternative Medicine. 2001