Azərbaycan respublikasi təHSİl naziRLİYİ baki döVLƏt universiteti Fakültə: Biologiya Kafedra

Fəsil 2. Gen eksperssiyasına aktivatorların təsiri mexanizmi

Transkripsiya aktivatoru bir genin və ya genlər dəstinin transkripsiyasını artıran zülaldır (transkripsiya faktoru). Aktivatorlar gen ifadəsi üzərində müsbət nəzarətə malik hesab edilir, çünki onlar gen transkripsiyasını təşviq etmək funksiyasını yerinə yetirir və bəzi hallarda genlərin transkripsiyasının baş verməsi üçün tələb olunur. Əksər aktivatorlar gücləndiricilərə və ya promotor-proksimal elementlərə bağlanan DNT-ni bağlayan zülallardır.Aktivator tərəfindən bağlanan DNT sahəsi "aktivator-bağlayıcı sayt" adlanır.Aktivatorun ümumi transkripsiya mexanizmi ilə zülal-zülal qarşılıqlı əlaqəsini yaradan hissəsi "aktivləşdirici bölgə" və ya "aktivləşdirmə sahəsi" adlanır.

Əksər aktivatorlar ardıcıllıqla - xüsusi olaraq promotorun yaxınlığında yerləşən tənzimləyici DNT sahəsinə bağlanaraq və ümumi transkripsiya mexanizmləri (RNT polimeraza və ümumi transkripsiya faktorları) ilə zülal-zülal qarşılıqlı əlaqəsi yaratmaqla fəaliyyət göstərir və bununla da ümumi transkripsiya mexanizminin promotorla bağlanmasını asanlaşdırır. Digər aktivatorlar RNT polimerazını promotordan azad etmək və DNT boyunca davam etmək üçün tetikleyerek gen transkripsiyasını təşviq etməyə kömək edir. Bəzən RNT polimeraza promotordan ayrıldıqdan qısa müddət sonra fasilə verə bilər; aktivatorlar həmçinin bu “dayanmış” RNT polimerazalarının transkripsiyanı davam etdirməsinə imkan vermək üçün fəaliyyət göstərir.

Aktivləşdiricilərin fəaliyyəti tənzimlənə bilər. Bəzi aktivatorlar allosterik sahəyə malikdir və yalnız müəyyən bir molekul bu sahəyə bağlandıqda, aktivatoru işə saldıqda fəaliyyət göstərə bilər.Aktivləşdiricilərə tərcümədən sonrakı dəyişikliklər də modifikasiyanın növündən və dəyişdirilən aktivatordan asılı olaraq fəaliyyəti artıra və ya azaldaraq fəaliyyəti tənzimləyə bilər(4).

Bəzi hüceyrələrdə, adətən eukaryotlarda, çoxlu aktivatorlar bağlanma yerinə bağlana bilər; bu aktivatorlar kooperativ bağlanmağa və sinergik şəkildə qarşılıqlı təsirə meyllidirlər.Aktivləşdirici zülallar iki əsas domendən ibarətdir: aktivatora xas olan DNT ardıcıllığına bağlanan DNT-ni bağlayan domen və digər molekullarla qarşılıqlı əlaqədə olmaqla gen transkripsiyasını artırmaq funksiyasını yerinə yetirən aktivləşdirmə sahəsi.Aktivləşdirici DNT-ni bağlayan domenlər müxtəlif konformasiyalarda olur, o cümlədən, spiral döngəsi, sink barmağı və digərləri arasında leysin fermuarı.Bu DNT-ni bağlayan domenlər müəyyən DNT ardıcıllığına xasdır və aktivatorlara yalnız müəyyən genləri işə salmağa imkan verir. Aktivləşdirmə domenləri həmçinin alaninlə zəngin, qlutaminlə zəngin və asidik domenlər daxil olmaqla, domenin amin turşusu ardıcıllığına əsasən təsnif edilən müxtəlif növlərdə olur. Bu domenlər o qədər də spesifik deyil və müxtəlif hədəf molekulları ilə qarşılıqlı əlaqədə olurlar(7).

Aktivləşdiricilərdə aktivatorların özlərini yandırıb-söndürməkdən məsul olan allosterik saytlar da ola bilər.DNT cüt spiralının yivlərində əsas cütlərin funksional qrupları ifşa olunur.Beləliklə, DNT-nin ardıcıllığı mümkün hidrogen əlaqəsi, ion əlaqəsi, eləcə də hidrofobik qarşılıqlı təsir sahələri daxil olmaqla, səth xüsusiyyətlərinin unikal modelini yaradır. Aktivatorlar həmçinin DNT-dəki funksional qruplarla qarşılıqlı əlaqədə ola bilən yan zəncirli amin turşularının unikal ardıcıllığına malikdir.Beləliklə, aktivator zülalını təşkil edən amin turşusu yan zəncirlərinin nümunəsi, onun bağlanması üçün nəzərdə tutulmuş xüsusi DNT tənzimləmə ardıcıllığının səth xüsusiyyətlərinə tamamlayıcı olacaqdır Aktivləşdirici zülalın amin turşuları ilə DNT-nin funksional qrupları arasında tamamlayıcı qarşılıqlı əlaqə aktivator və onun tənzimləyici DNT ardıcıllığı arasında “dəqiq uyğunluq” spesifikliyi yaradır.Əksər aktivatorlar qoşa spiralın əsas yivlərinə bağlanır, çünki bu sahələr daha geniş olur, lakin bəziləri kiçik yivlərə bağlanır(8).

Aktivatoru bağlayan saytlar promouterə çox yaxın və ya çoxsaylı baza cütləri uzaqda yerləşə bilər.Əgər tənzimləyici ardıcıllıq uzaqda yerləşirsə, bağlanmış aktivatorun promotor yerindəki transkripsiya mexanizmi ilə qarşılıqlı əlaqədə olması üçün DNT öz üzərində dönəcək (DNT dövrəsi).Prokaryotlarda çoxlu genlər birlikdə transkripsiya edilə bilər (operon) və beləliklə, eyni tənzimləyici ardıcıllıqla idarə olunur.Eukariotlarda genlər fərdi şəkildə transkripsiyaya meyllidir və hər bir gen öz tənzimləyici ardıcıllığı ilə idarə olunur.Aktivatorların bağlandığı tənzimləyici ardıcıllıqlar adətən promotordan yuxarıda tapılır, lakin onlar həmçinin eukariotlarda aşağı axın və ya hətta intronların içərisində tapıla bilər.

TALE aktivatorlarının kombinator istifadəsi əlçatmaz xromatin bölgələrində müəyyən hüceyrə genlərini seçici şəkildə aktivləşdirə bilər. Bu işdə, qeyri-immun hüceyrələr kontekstində transkripsiya ilə susdurulmuş immun genlər üzərində TALE-lərin aktivləşmə potensialını sorğulamağı hədəflədik. Biz unikal strategiya hazırlamışıq ki, burada TATA qutusu bağlayan zülal (TBP-TALE) ilə birləşdirilən tək TALE çoxlu VP64-TALE aktivatorları ilə birləşdirilir. Hər iki genin tamamilə susdurulduğu müxtəlif hüceyrə mənşəlilərində IL-2 və GM-CSF ifadəsini aktivləşdirmək üçün strategiyamızın tək TALE aktivatorlarından əhəmiyyətli dərəcədə daha güclü olduğunu gördük. Xromatin təhlili göstərdi ki, genin aktivləşməsi qismən aydın şəkildə yerləşdirilmiş nukleosomun yerdəyişməsi ilə bağlıdır. Bu tədqiqatlar süni gen induksiyası üçün yeni epigenetik mexanizm təmin edir və məqsədyönlü xərçəng immunoterapiyası, DNT vaksinin inkişafı, eləcə də TALE aktivatorlarının rasional dizaynı üçün mühüm təsirlərə malikdir(3).

Transkripsiya Aktivatoruna Bənzər Effektorlar (TALE) texnologiyası hədəflənmiş genom manipulyasiyası üçün sürətlə inkişaf edən alətdən ibarətdir. 2009-cu ildə TALE DNT tanınma kodunun deşifrə edilməsi müxtəlif məqsədlər üçün bir sıra yeni mühəndis TALE kimeralarının inkişafına səbəb oldu . Məsələn, TALE-lər gen ifadəsini modulyasiya etmək, epigenetik modifikasiyaları yenidən proqramlaşdırmaq , TALEN və ya kimerik TALE rekombinazlarından istifadə edərək genləri təmir etmək və ya pozmaq və təşviq etmək üçün hazırlanmışdır. TALE yönümlü piggyBac istifadə edərək hədəflənmiş gen transpozisiyası. TALE-lər, yeni tipli DNT bağlayan domeninə (DBD) aid edilən mahiyyətcə sadə və proqnozlaşdırıla bilən DNT tanınma koduna görə ənənəvi sink barmağına əsaslanan texnologiyalar üzərində cəlbedici üstünlük təklif edir. TALE DBD yüksək dərəcədə təkrarlanır və ~20 amin turşusundan ibarət sonuncu təkrar vahid istisna olmaqla, hər bir monomer ~34 amin turşusundan ibarət olan təkrar monomerlərin tandem sırasını. Hər təkrarlama, xüsusi olaraq təkrar dəyişən di-qalıq (RVD) kimi tanınan hər təkrar monomerin 12-ci və 13-cü amin turşusu mövqelərində koordinasiya edilmiş tək DNT əsas cütünü birləşdirir və aşağıdakı deşifrə koduna malikdir: NI = A, HD = C, NG = T, NN = G/A. Sink barmaq zülallarından fərqli olaraq, TALE təkrar monomerləri ilə DNT-nin tanınması ardıcıl kontekst tələblərinə malik deyildir və sink barmaqlarına nisbətən daha az hüceyrə toksikliyi nümayiş etdirir. Bu günə qədər TALE texnologiyası model orqanizmlərin geniş spektrinə tətbiq edilmişdir . Beləliklə, TALE texnologiyası model orqanizmlərdə funksional genomikanın öyrənilməsi, yeni gen terapiyalarının və innovativ sintetik biologiya vasitələrinin inkişafı üçün vacib olan genom mühəndisliyi alətlərini inkişaf etdirmək üçün yaxşı qurulmuş və çox yönlü platforma təmin edir(5).

TALEN-lərə nisbətən, TALE-lərin aktivator kimi potensialı son vaxtlara qədər tam öyrənilməmişdir. İlkin tədqiqatlar göstərdi ki, tək TALE aktivatoru müxtəlif hüceyrə genlərindən əldə edilən sintetik promotorla əlaqəli müxbir genin ifadəsini idarə edə bilir. Bununla birlikdə, sintetik promotorlardan fərqli olaraq, endogen genlərin TALE vasitəçiliyi ilə aktivləşdirilməsi yalnız orta səviyyədə idi və bəzi hallarda gen ifadəsini tamamilə aktivləşdirə bilmədi. Əlavə təhlillər müəyyən etdi ki, epigenetik olaraq susdurulmuş genin aktivləşdirilməsi TALE aktivatoru ilə birlikdə fəaliyyət göstərən epigenetik dəyişdiricilərin birləşməsini tələb edir, tək TALE isə belə bir kombinator effekti stimullaşdıra bilmir və buna görə də susdurulmuş Oct4 promotorunu aktivləşdirməkdə səmərəsizdir. Bu yaxınlarda iki tədqiqat göstərdi ki, sinergetik gen aktivasiyası üçün bir çox TALE aktivatorunu bir gen promotoruna yönəltməklə bu məhdudiyyəti aradan qaldırmaq olar. Bundan əlavə, bu tədqiqatlar göstərir ki, TALE aktivatorlarının gen promotorları daxilində xromatin bölgələrini açmaq üçün hədəflənməsi müvəffəqiyyətli gen aktivasiyası üçün tələb deyil və TALE-lərin bir gen promotoruna kooperativ bağlanma yolu ilə repressiv xromatin strukturlarını üstələyə biləcəyini təklif edir. Bununla belə, TATA qutusu və transkripsiyanın başlanğıc sahəsi kimi promotor bölgələrdəki bəzi əsas elementlər gen aktivləşdirmə məqsədləri üçün TALE texnologiyası kontekstində tam olaraq qiymətləndirilməmişdir.

Eukaryotik hüceyrələrdə transkripsiyanın başlaması promotora xas transkripsiya aktivatorlarının gen promotoru daxilində onların qohum DNT cavab elementlərinə tanınması və bağlanması ilə başlayır. Aktivator xromatin remodelyatorlarını və bazal transkripsiya mexanizminin komponentlərini işə götürmək və yığmaq üçün platforma kimi fəaliyyət göstərir. Daha dəqiq desək, aktivatorlar TATA qutusunu bağlayan proteini (TBP) gen promotorlarına cəlb edir, nəticədə TBP ilə əlaqəli amillər (TAF), transkripsiya faktoru II zülalları (məsələn, TFIIB) və RNT-dən ibarət ilkin başlanğıc kompleksinin (PIC) əmələ gəlməsi ilə nəticələnir. mRNT transkripsiyasını stimullaşdırmaq üçün Pol II (RNAP) . Nəticə etibarilə, TBP-nin TATA qutusuna bağlanması transkripsiyanın başlanğıcında sürəti məhdudlaşdıran addımdır(5).

Beləliklə, biz müəyyən bir TATA qutusuna əlaqəli TALE DNT-ni bağlayan domendən (DBD) istifadə edərək TBP-nin məqsədyönlü cəlb edilməsinin bu vacib sürəti məhdudlaşdıran addımı keçərək seçilmiş genin transkripsiyaya başlamasına səbəb ola biləcəyini əsaslandırdıq. Bir sıra tədqiqatlar göstərdi ki, klassik olmayan aktivatorların (məsələn, TBP) klassik aktivatorlarla (məsələn, VP16) birlikdə süni şəkildə işə götürülməsi gen ifadəsini sinerjiləşdirə bilər. Bu günə qədər heç bir tədqiqat səssiz gen ifadəsinin məqsədyönlü aktivləşdirilməsi üçün TALE aktivatorlarından istifadə edərək belə bir strategiyanın faydasını araşdırmayıb. Buna görə də, IL-2 və GM-CSF genləri ilə təsvir edilən T-hüceyrə biologiyasında müşahidə edilən klassik gen susdurma nümunəsinə tətbiq olunan kimerik TBP və VP64-TALE aktivatorlarının birgə fəaliyyətindən istifadə edərək TALE aktivləşdirmə potensialını sorğulamağı hədəflədik.

Hüceyrə mədəniyyəti mediaları transfeksiyadan 72 saat sonra toplandı və sonradan istifadə üçün -80 ° C-də donduruldu. Təhlil günü nümunələr 37°C-də əridildi və hüceyrə mədəniyyəti mühiti Amicon ultracel-10 toplama vahidlərindən (Millipore) istifadə etməklə 30 dəfə konsentrasiya edildi. İfraz olunmuş IL-2 zülalı Quantikine IL-2 ELISA aşkarlama dəsti (R&D Systems) və ifraz olunan GM-CSF proteini Human GM-CSF ELISA Ready-SET-Go! (eBioscience) istehsalçının təlimatlarına uyğun olaraq. IL-2 və/və ya GM-CSF zülalının kəmiyyətini müəyyən etmək üçün x oxundakı konsentrasiyaya və xətti reqressiya təhlili ilə müəyyən edilmiş ən yaxşı uyğunluq xəttinə qarşı y oxundakı hər bir standart üçün orta absorbans kimi standart əyri çəkildi. GM-CSF ELISA üçün nümunələrdə GM-CSF zülalının miqdarı fon çıxma yolu ilə boş vektor nəzarətinə normallaşdırıldı. TBP-TALE qeyri-immun hüceyrələrdə susdurulmuş IL-2 geninin ifadəsini effektiv şəkildə aktivləşdirə bilər.Tipik TALE aktivatorunda fərdi komponentlərin tərkibi Şəkil 1A-da təsvir edilmişdir. TALE-lər bildirilmiş N1-C2 arxitekturasına əsaslanmış, invariant 5′ timini saxlamış və DNT-nin tanınması üçün adi RVD kodundan istifadə etmişdir (Şəkil 5).

Şəkil 5. IL-2 promotorunu hədəf alan TALE aktivatorlarının dizaynı.

IL-2 promotor bölgəsində transkripsiya başlanğıc yerindən (TSS) təxminən 100 bp yuxarıda müxtəlif lokusları hədəf alan beşə qədər TALE aktivatoru qurduq (Şəkil 1B, Cədvəl 1). Həmin TALE-lərdən ikisi, IL2B və IL2D, xüsusilə TATA qutusunu hədəf alır (Şəkil 1B, Cədvəl 1). TATA-qutusu bağlayan TALE-lər istisna olmaqla, bütün konstruksiyalar güclü VP64 transaktivasiya domeninə birləşdirildi; halbuki, TATA qutusuna yönəldilmiş TALE-lər müqayisəli təhlil üçün VP64 (IL2B və ya IL2D) və ya TBP (IL2B' və ya IL2D') ilə birləşdirildi. Potensial hədəfdən kənar təsirlərin qarşısını almaq üçün bütün TALE-lər guanin qalıqlarında aşağı bölgələrə malik 15-16 bp DNT hədəf sahəsini tanımaq üçün nəzərdə tutulmuşdur (6).

Yuxardakı şəkildə (A) Mühəndis TALE konstruksiyasının təsviri. HA, hemaglutinin epitopu; NLS, SV40 nüvə lokalizasiya siqnalı; T0, invariant timin qalığının tanınması; AD, aktivləşdirmə sahəsi - VP64 və ya TATA-qutusu bağlayan protein (TBP). Quruluşun altında tipik təkrar domeninin amin turşusu tərkibi və DNT-nin tanınması üçün istifadə edilən RVD-lər verilmişdir. (B) IL-2 promotorunun sxemi (miqyasda çəkilməmişdir) və hər bir TALE konstruksiyasının transkripsiya başlanğıc sahəsinə (TSS) nisbətən təxmini mövqeyi. Hər TALE 'IL2' və sonra ona uyğun əlifba ilə işarələnir. TATA qutusuna bağlanan TALE-lər və onların qohum DNT saytları aşağıda göstərilmişdir. Müqayisəli təhlil üçün VP64 (IL2B və ya IL2D) və ya TBP (IL2B' və ya IL2D') ilə birləşdirilən TATA qutusuna bağlanan TALE-lər istisna olmaqla, bütün TALE-lər VP64-ə birləşdirilir. TATA qutusu yaşıl rənglə göstərilmişdir. TSS qırmızı rənglə göstərilir.

Bu TALE konstruksiyalarının qeyri-immun hüceyrələrdə səssiz IL-2 genini aktivləşdirə biləcəyini yoxlamaq üçün iki, üç və ya dörd TALE aktivatorunun birləşməsindən istifadə edərək onları 293FT hüceyrələrinə köçürdük. TBP-TALE funksiyasının müqayisəli təhlili üçün TALE birləşmələri VP64 (IL2B və ya IL2D) və ya TBP (IL2B' və ya IL2D') ilə birləşdirilən TALE-ləri hədəfləyən TATA qutularından biri ilə quruldu və sonra göstərilən VP64 ilə birlikdə istifadə edildi. -TALE aktivatorları (IL2A, IL2C, IL2F). Transfeksiyadan üç gün sonra ümumi RNT və hüceyrə mədəniyyəti mühiti müvafiq olaraq IL-2 transkriptinin və zülalının qRT-PCR və ELISA kəmiyyətinin müəyyən edilməsi üçün toplandı. Başqalarının son ​​hesabatları ilə razılaşaraq, VP64-TALE aktivatorlarının kombinasiyası onların IL-2 transkriptlərinin ifadəsini aktivləşdirməkdə aktivliyini əhəmiyyətli dərəcədə gücləndirir (Şəkil 6).

Şəkil 6. Unikal kimerik TBP-TALE güclü və təkmilləşdirilmiş IL-2 geninin aktivləşdirilməsini təmin edir.

Gücləndirici təsir üç və dörd VP64-TALE aktivator kombinasiyasında ən aydın idi. Bununla belə, adi TALE aktivatorlarından birinin (IL2B və ya IL2D) TBP-TALE (IL2B' və ya IL2D') ilə əvəz edilməsi, yalnız VP64-TALE-lərlə müqayisədə IL-2 ifadəsinin 4 dəfəyə qədər artması ilə nəticələndi. IL-2 induksiyası boş vektor nəzarətindən təxminən 10 000 dəfə çoxdur. Göstərilməyən məlumatlarda transfeksiya edilməmiş hüceyrələr IL-2 transkriptlərinin bazal səviyyəsində boş vektor nəzarəti ilə müqayisədə əhəmiyyətli fərq nümayiş etdirməmişdir ki, bu da IL-2 gen ifadəsinin transaktivləşməsi ilə DNT transfeksiyasının deyil, TALE aktivatorlarının nəticələndiyini göstərir. IL-2 gen transkriptlərində müşahidə edilən artımla razılaşaraq, bu sitokinin zülal forması tək VP64-TALE aktivatorları ilə müqayisədə VP64-TALE-nin TBP-TALE ilə əvəz edilməsi ilə 11 dəfəyə qədər artırıldı (9).

Susdurulmuş immun gen ifadəsində TALE vasitəçiliyi ilə aktivləşdirməni daha da nümayiş etdirmək üçün biz ikinci immunomodulyator geni, qranulosit-makrofaq koloniya stimullaşdırıcı faktoru (GM-CSF) hədəf aldıq. IL-2 promotoruna bənzər olaraq, GM-CSF geninin tənzimləyici bölgəsi yalnız T-hüceyrələrində düzgün TCR siqnalı zamanı və ya fibroblast və ya endotel hüceyrələrində immunostimulyatorlarla aktivləşdirilir . Son hesabatlar göstərdi ki, gen ifadəsini güclü şəkildə idarə etmək üçün altıya qədər TALE aktivatoru tələb oluna bilər, biz ~500 bp ərazini əhatə edən GM-CSF promouteri boyunca müxtəlif mövqeləri hədəfləmək üçün altıya qədər TALE dizayn etdik. TSS-nin yuxarı axını. GM-CSF TALE-ləri Cədvəl 2-də göstərildiyi kimi minimal guanin tərkibinə malik 15-20 bp hədəf sahələrini tanımaq üçün IL-2-ninkinə oxşar şəkildə tərtib edilmişdir. IL-2-yə məxsus TALE-lərə uyğun olaraq, G1-TBP (G1' ) çoxsaylı GM-CSF spesifik VP64-TALE aktivatorları ilə kombinasiya 293FT hüceyrələrində həm dörd, həm də altı aktivator kombinasiyasından istifadə edərkən, yalnız VP64-TALE-lərdən fərqli olaraq gen ifadəsinin 2 dəfədən çox artması ilə nəticələndi (Şəkil 6A). Əslində, G1-TBP (G1') üstəgəl üç əlavə VP64-TALE-nin (G2, G3 və G4) daxil edilməsi altı VP64-TALE-nin (G1-G6) hamısından istifadə etdiyi kimi işləyirdi. G1-TBP (G1') əlavə VP64-TALE ilə birləşməsindən istifadə edərək yüksəlmiş gen transkripsiyası, bu genin tamamilə susdurulduğu 293FT hüceyrələrinin mədəniyyət mühitində asanlıqla aşkar edilə bilən səviyyədə GM-CSF zülalının sərbəst buraxılmasına səbəb oldu. Birlikdə götürüldükdə, bu məlumatlar TBP-TALE-nin VP64-TALE aktivatorları ilə birlikdə istifadə edildikdə onların ifadəsini sinergik şəkildə aktivləşdirmək üçün bir çox susdurulmuş məməli genlərinə tətbiq oluna bilən güclü aktivatorların yeni sinfini təmsil etdiyini göstərir (Şəkil 7).

Şəkil 7. TALE aktivatorlarından istifadə edərək səssiz GM-CSF promotorunun hədəflənməsi.

GM-CSF promotorunun sxemi və GM-CSF TALE aktivatorlarının TSS-ə nisbətən təxmini yeri (miqyasda çəkilməyib). TALE şəxsiyyəti hər bir TALE illüstrasiyasının üstündə işarələnmişdir. GM-CSF TALE-lər TSS-nin 500 bp daxilində hədəflənir. TALE-G1 TATA qutusu ilə birləşir və onun qohum DNT ardıcıllığı aşağıda göstərilmişdir. Müqayisəli təhlil üçün VP64 (G1 kimi qeyd olunur) və ya TBP (G1' kimi qeyd olunur) ilə birləşdirilən TALE-G1 istisna olmaqla, bütün TALE-lər VP64-ə birləşdirilir. TATA qutusu yaşıl rənglə vurğulanır və onun TSS-ə nisbətən mövqeyi (qırmızı) aşağıda göstərilir.Əvvəlki tədqiqatlar göstərmişdir ki, istirahət edən T-hüceyrələri fərqli bir nukleosomu TSS-dən yuxarı 60-200 bp arasında yerləşdirə bilər və IL-2 promotorunu qeyri-aktiv edir. T-hüceyrəsinin aktivləşdirilməsi zamanı bu fərqli nukleosom sonradan yerdəyişmə olur və artan DNaz I həssaslığı və ardınca IL-2 geninin aktivləşməsi ilə müşayiət olunur.(2).

CHART-PCR real vaxt qPCR ilə ölçülən DNaz I parçalanması üçün müəyyən bir DNT bölgəsinin əlçatanlığını kəmiyyətcə ölçür. Konsepsiyada açıq və ya rahat xromatin DNT-nin bölgələri DNase I parçalanmasına daha həssasdır, qapalı xromatin DNT-nin bölgələri isə parçalanmaya davamlıdır. Beləliklə, biz TALE aktivatorlarının mövcudluğunda IL-2 promotorunun boş vektor nəzarətindən daha çox DNase I parçalanmasına daha həssas olacağını fərz etdik. Şəkil 7A-da göstərildiyi kimi, IL-2 promotor bölgəsində müxtəlif lokusların əlçatanlıq vəziyyətini yoxlamaq üçün bir sıra primerlər nəzərdə tutulmuşdur. CHART-PCR nəticələri göstərdi ki, AD’CF TALE-lərin birləşməsi, lakin boş vektor nəzarəti deyil, IL-2 promotoru üzərində DNaz I yüksək həssaslığını artırdı və primer dəstləri 2 və 3 tərəfindən yoxlanılan bölgələrdə əhəmiyyətli artım müşahidə edildi. Maraqlıdır ki, hər iki primer ya istirahət T-hüceyrələrində aşkar edilmiş aydın şəkildə yerləşdirilmiş nukleosomun yaxınlığında və ya TSS daxilində gücləndirilmiş genomik bölgələri təyin edir. Bu məlumatlar birlikdə TBP-TALE-nin VP64-TALE-lərlə birlikdə nukleosomu aşkarlama diapazonundan kənara çıxardığını və ya yerini dəyişdirdiyini nümayiş etdirir ki, TALE aktivatorlarının gen aktivləşdirilməsinə nəzarət edən IL-2 promotorunun tənzimləyici bölgələrinə eksklüziv çıxışına imkan yaradır. Bundan əlavə, bu məlumatlar stimullaşdırılmış T-hüceyrələrində aktivləşdirilmiş IL-2 promotor vəziyyətini təsvir edən əvvəlki hesabatlara uyğundur və beləliklə, qeyri-immun hüceyrələrin oxşar tənzimləmə və xromatin konfiqurasiya mexanizminə məruz qaldığını göstərir(10).

Aşağıdakı şəkildə-(A) IL-2 promotoruna bağlanma zamanı təklif edilən TALE mexanizmi (miqyasda çəkilməmişdir). Üst panel TALE aktivatorlarının olmadığı halda IL-2 promotorunun təklif edilən xromatin strukturunun təsviridir. Cavab elementlərinin təxmini yeri əvvəllər dərc edilmiş məlumatlardan uyğunlaşdırılmışdır. Dairə TSS-dən təqribən 60-200 bp yuxarıda yerləşən yerləşdirilmiş nukleosomu təmsil edir. Qutulu qapalı 'T' TATA qutusunu təmsil edir. Aşağı panel TSS-ə nisbətən TALE aktivatorlarının yerini və IL-2 promotoruna təklif edilən təsir mexanizmini göstərir. IL-2 promotorunda müxtəlif bölgələri araşdırmaq üçün IL-2 spesifik primerləri istifadə edilmişdir. Oklar müvafiq primer dəsti ilə gücləndirilmiş hər bir bölgənin təxmini yerini göstərir. Bütün TALE aktivatorları TBP (aktivləşdirmə sahəsi qırmızı rəngli) ilə birləşdirilən IL2D istisna olmaqla, VP64 (aktivləşdirmə sahəsi yaşıl rəngli) ilə birləşdirildi. (B) CHART-PCR istifadə edərək xromatin analizinin nəticələri. Faiz əlçatanlığı Metodlarda təsvir olunduğu kimi hesablanmış və həm boş vektor nəzarəti (qara çubuqlar), həm də TALE aktivatorları (gölgələnmiş çubuqlar) üçün tərtib edilmişdir. GAPDH, DNaz I həzmini izləmək üçün daxili nəzarət kimi istifadə olunur (şəkil 8).

Şəkil 8. TALE-lər IL-2 promotorunda yerləşdirilmiş nukleosomun yerdəyişməsini asanlaşdırır.

Nəticə

1. 
   Gen eksperssiyasının (ifadəsinin) tənzimlənməsi və ya gen tənzimlənməsi, xüsusi gen məhsullarının (protein və ya RNT) istehsalını artırmaq və ya azaltmaq üçün hüceyrələr tərəfindən istifadə olunan geniş mexanizmləri əhatə edir. İnkişaf yollarını işə salmaq, ətraf mühitin stimullarına cavab vermək və ya yeni qida mənbələrinə uyğunlaşmaq üçün inkişaf etmiş gen ifadə proqramları geniş şəkildə biologiyada müşahidə edilir.
   
2. 
   Transkripsiya aktivatoru bir genin və ya genlər dəstinin transkripsiyasını artıran zülaldır (transkripsiya faktoru). Aktivatorlar gen ifadəsi üzərində müsbət nəzarətə malik hesab edilir, çünki onlar gen transkripsiyasını təşviq etmək funksiyasını yerinə yetirir və bəzi hallarda genlərin transkripsiyasının baş verməsi üçün tələb olunur.
   
3. 
   Əksər aktivatorlar ardıcıllıqla - xüsusi olaraq promotorun yaxınlığında yerləşən tənzimləyici DNT sahəsinə bağlanaraq və ümumi transkripsiya mexanizmləri (RNT polimeraza və ümumi transkripsiya faktorları) ilə zülal-zülal qarşılıqlı əlaqəsi yaratmaqla fəaliyyət göstərir və bununla da ümumi transkripsiya mexanizminin promotorla bağlanmasını asanlaşdırır.