Ekzon va intronlar. Gen klasterlari, promotor

GENOMNING RNK DARJASIDAGI TAXLILI; M-RNK
EKSPRESSIYASI, RT-..
Ribosoma o‗lchamlari tashqi ko‗rinishi va 2 ta bo‗laklarga bo‗linishi Ribosomalar elektron mikroskop ostida taxminan 25 nm lik o‗lchamdagi aylanasimon zarrachalar ko‗rinishida bo‗ladi, eukariotik ribosomalar taxminan 30 nm gacha bo‗lishi mumkin. Har xil organizmlar va hujayralar, shu jumladan prokariotik va eukariotik hujayra ribosomalari bir-biriga shakli va tuzilishi jihatdan juda o‗xshash bo‗ladi. ribosomani xarakterlaydigan belgilardan biri ribosomani ikkita teng bo‗lmagan bo‗laklarga ajratuvchi chiziqdir. Bu belgi shuni ko‗rsatdiki, ribosoma 2 ta ajraladigan bo‗lakcha yoki subbirliklardan tashkil topgan. Masalan, muhitda Mg2+ ionlari konsentratsiyasining etarli darajada pasaytirilganda ribosomaning taxminan massasi 2:1 nisbatdagi bo‗lakchalarga bo‗linadi. Eukariotik 80S ribosomasi 60S va 40S subzarralarga bo‗linishi mumkin.
Polimer zanjir reaksiyasi ( PZR ) Ma'lum bir hujayradagi mitoxondriyaning DNK sini ajratib olishning o'zi uzoq davom etadigan laboratoriya tajribalarini talab etadi . Ajratib oldik ham deylik , lekin bir dona namuna bilan jarayonni davom ettirish mumkinmi ? Butun boshli DNK ichidan bizga kerakli COI genini qanday ajratib olamiz ? Bu borada DNK ning qay darajada kichik ekanligini hisobga oling . Agar COI genida 600 ta atrofida nukleotid borligi hisobga olsak , demak uning uzunligi 200 nm atrofida bo'ladi . Bu degani 0,0002 mm degani ( ! ) . Bizga ushbu namunadan juda ko'plab sonda kerak , ana shundagina ishni davom ettirsak bo'ladi . Lekin qanday ? 1983 yilda AQSH biokimyogari Keri Mullis praymerlarni qo'llagan holda kichik bir DNK bo'lagini istalgan miqdorda ko'paytinsh usulini kashf etdi . Usulning nomi polimer zanjir reaksiyasi edi . Molekulyar biologiyadagi ushbu revolutsion kashfiyot uchun Keri Mullis 1993 yilda Nobel mukofoti bilan tadqirlanadi . Praymer - bu bizga kerakli 600 ta nukleotidli DNK bo'lagining boshlanish va tugash qismidagi dastlabki 10-15 ta nukleotidlar qatori . U orqali biz uzun DNK bo'lagidan aynan bizga kerakli qismni topa olamiz va xuddi o'sha qismdan boshlab DNKni replikatsiyal qilishimiz mumkin . Jarayonda bundan tashqari albatta erkin nukleotidlar va polimeraza fermenti ishtirok etadi .
PZR jarayoni asosiy uch bosqichdan iborat Denaturatsiyalash - ya'ni , DNK zanjirini ikkiga ajratish ; Praymerlarning DNK dagi kerakli joyga birikishi ; Replikatsiya jarayoni . PZR jarayoni maxsus PZR mashinasida olib boriladi . U har bir jarayon bosqichi uchun zarur bo'lgan haroratni boshqarib turadi .
PZR-amplifikatsiyasi usuli - Amplifikatsiya uchun ajratib olingan Ostertagia avlodi turlarining genom DNKsini xromasomadagi ribosomal DNKni ITS (ichki transkrib speyseri) sohasining nukleotidlar ketma-ketligini o‗rganish uchun «Sileks» firmasi to‗plami reaktivlari – sterillangan suv, 10x PZR bufferi, dNTP eritmasi, Taq-polimerazasi va molekulyar taksonomiyasida qo‗llanilayotgan quyidagi praymerlardan foydalanilib amplifikatsiya qo‗yildi. Polimeraza zanjirli reaksiyasi (PZR) avtomatik dasturlashtiriluvchi amplifikator (Touchgene Gradient, UK) yordamida amalga oshirildi. Firma qaydnomasi asosida quyidagi reaktivlardan Master-mix tayyorlandi.
PZR quyidagi sxema bo‗yicha amalga oshirildi: 1 – bosqich – 3 daqiqa davomida DNK ning 95° S sharoitda denaturatsiyalanishi, 2 – bosqich – DNKning 93° S sharoitda 20 soniya davomida denaturatsiyalanishi, 3 – bosqich – DNKda 55° S sharoitda 30 soniya davomida praymerlarning yopishishiµ, 4 – bosqich – 72° S sharoitda 2 daqiqa davomida elongatsiyalanish, 5 – bosqich – 72° S sharoitda 10 daqiqa davomida zanjirning elongatsiyalanishi. Ikkinchidan to‗rtinchi bosqichgacha jarayon sikl ko‗rinishida 30 martagacha takrorlangan.
Agaroza gelida elektroforez usuli -Polimeraza zanjir reaksiyasi tugaganidan so‗ng gelelektroforez usulidan foydalanildi. Bu usul - analitik metod bo‗lib, ajratish, tenglashtirish va DNK qismlarini tozalash uchun foydalaniladi. DNK elektroforezi gorizontal yo‗nalishda amalga oshiriladi (Osterman, 1996). Gelning tarkibiga quyidagilar kiradi: 1X TAE (rN 8,1), agaroza, bromli etidiy. Agaroza gelini tayyorlash va PZR mahsulotlarida elektroforez o‘tkazish uchun қuyidagi ketma - ketlikda amalga oshirildi.
1. Gelni elektroforez vannachasiga qo‗yishdan avval namunalarni kiritish uchun plastinkaoynali taroqchalarni o‗rnatib chuqurchalar (lunka) yasab olindi. Taroqchalarning pastki tishchalari umumiy hajmi 50 ml bo‗lgan gelning asosidan 2 mm oralig‗ida joylashsin (umumiy hajmi 150 ml bo‗lgan gelning asosidan 1mm oralig‗ida joylashtirilgan).
2. 50ml 2%li agaroza gelini tayyorlash uchun 50 ml 1X TAE va 1g agaroza qo‗shiladi. 1X TAE boshlang‗ich konsentratsiyasi 50X TAE eritmasidan tayyorlanadi. (Tris, 0,5M EDTA pH 8,0, muzlatilgan uksus kislotasi).
3. Kolbaga solingan agarozali TAE aralashmasini qizdiriladi, eritma gomogen holatiga kelguncha, ya‘ni agarozaning erimagan zarralarini bo‗lmasligi lozim.
4. Bu jarayondan so‗ng 50°S darajasida sovutildi va 0,5 mkl bromli etidiy qo‗shildi.
5. Hamma gel hajmi elektroforez vannachasiga quyildi. Gel sovugandan so‗ng (30-45 daqiqa xona haroratida), sekinlik bilan taroqchalarni olib tashlandi va elektroforez vannachasiga 1X TAE buferini gel to‗liq qoplanmagunga qadar quyildi.
6. 10-15 daqiqadan so‗ng chuqurchalarning (lunka) biriga 2,5 mkl li DNK-markerini DNA Ladder 100pb (Promega) qo‗shildi.
7. DNK ajratishi uchun kuchlanish 1 santimetr gelda 5 voltdan oshmasligi zarur.
8. 40-45 daqiqadan so‗ng gelni ultrabinafsha va transillyuminator nurlarida ko‗riladi va rasmga olinadi, natijalar qayd qilinadi.
Elektroforez ( elektro - yunoncha - siljish ) , Elektroforez zaryadlangan zarralar - ionlarning elektr toki ta'sirida qarama - qarshi zaryadlangan elektr tomon ( ya'ni musbat zaryadlangan ionlar manfiy elektrodga va manfiy zaryadlangan ionlar musbat elektrodga ) harakatlanishiga asoslangan . Elektroforez - bu nisbatan bir xil elektr maydon doirasidagi gel yoki suyuqlikdagi zarralarning harakatini tavsiflash uchun ishlatiladigan a'tama . Elektroforezdan zaryad , o'lcham va bog'lanish yaqinligiga qarab molekulalarni ajratish uchun foydalanish mumkin . Asosan DNK , RNK , oqsillar , nuklein kislotalar , plazmidalar va shu makromolekulalarning bo'laklari kabi biomolekulalarni ajratish va tahlil qilish uchun qo'llaniladi . Elektroforez - aynan DNKni aniqlashda qo'llaniladigan usullardan biridir . Anionlar yoki manfiy zaryadlangan zarrachalarning elektroforezi deyiladi anaforez . Kationlarning yoki musbat zaryadlangan zarralarning elektroforezi deyiladi kataforez .
ELEKTROFOREZ TURLARI Elektroforez bir nechta tegishli analitik metodlarni o'z ichiga oladi . Bunga misollar : YAQINLIK ELEKTROFOREZI - Affinity elektroforezi- bu murakkab shakllanish yoki biospetsifik shovqin asosida zarralar ajratilgan elektroforez turi . KAPILLYAR ELEKTROFOREZ - Kapillyar elektroforez - bu asosan atom radiusi , zaryadi va yopishqoqligiga qarab ionlarni ajratish uchun ishlatiladigan elektroforez turi . Nomidan ko'rinib turibdiki , ushbu texnik odatda shisha naychada amalga oshiriladi . Bu tezkor natijalarni va yuqori aniqlikdagi ajralishni beradi . GEL ELEKTROFOREZI- Gel elektroforezi- bu elektroforezning keng qo'llaniladigan turi bo'lib , unda elektr maydon ta'sirida g'ovakli gel orqali harakatlanish natijasida molekulalar ajratiladi . Ikki asosiy gel materiallari agaroz va poliakrilamiddir . Gel elektroforezi nuklein kislotalarni ( DNK va RNK ) , nuklein kislota parchalarini va oqsillarni ajratish uchun ishlatiladi . IMMUNOELEKTROFOREZ - Immunoelektroforez - bu antitellarga reaktsiyasi asosida oqsillarni tavsiflash va ajratish uchun ishlatiladigan turli xil elektroforetik texnikalarning umumiy nomi
DNKni tozalash - Elektroforez natijasidan hosil bo‗lgan kerakli fragmentlarni skalpel yordamida geldan kesib olindi va 1.5 mlli epindorf probirkaga joylashtirildi. DNKni geldan ajratib olishda ishlab chiqaruvchi ko‗rsatmalariga amal qilgan holda, «Sileks M» (Rossiya, Moskva) tomonidan ishlab chiqarilgan reaktivlar to‗plamidan foydalanildi.

Sekvenirlash – DNKning nukleotidlar ketma-ketligini aniqlash - Geldan tozalangan PZR mahsulotlarini sikvenirlashga berishda, geldan tozalangan DNK konsetratsiyalari o‗lchandi hamda PZR ga qo‗yilgan praymerlar yordamida sekvensga berildi