Evolyusion jarayonning o’rganish metodlari. T. I.: «uch parallel uslubi», morfologik, embriologik va paleontologik usullar, biogeografik va sistematik usul, genetik, molekulyar biologik va immunologik usullar

4. DNKni Sekvenirlash. T.I.: Sekvinirlash mohiyati, usullari, «Plyus-minus» metodi, Sengerning didezoksi-metodi, Maksam-Gilbert metodi, DNK ni avtomatik sekvenirlash.

Nuklein kislotalarni sekvinirlash- ulardagi nukleotidlar ketma-ketligini aniqlashdir (lot. Sequentum-ketma-ketlik). Sekvinirlash natijasida nuklein kislotalarning birlamchi strukturasi haqida ma’lumotlar olinadi (monomerlarning ketma-ket joylashuvi haqida).

Sekvinirlanuvchi qismlarning o’lchami turli-tuman bo’lishi mumkin va, odatda, 100 yoki 1000 juft nukleotidlardan yoki undan katta bo’lishi mumkin. Sekvinirlash natijasida genning ma’lum qismlari, to’liq gen, RNK genlari yoki hatto organizmning to’liq genomi ketma-ketligini aniqlash mumkin. Sekvenirlashuslublari. Sekvinirlash uchun bir necha xil (Senger, Maksam-Gilbert va boshka) uslublardan foydalaniladi. Hozirgi vaqtda genlarni sekvinirlash uchun, asosan, didezoksinukleozidtrifosfatlarni   (ddNTP) qo’llashga asoslangan Senger uslubidan foydalaniladi. Odatda, sekvinirlashdan oldin ketma-ketligi aniqlanishi zarur bo’lgan DNK uchastkasining PZR yordamida amplifikasiyasi amalga oshiriladi. Agar genomning to’liq ketma-ketligi aniqlanishi zarur bo’lsa, sekvinirlashning yangi avlod texnologiyasidan (next-generation sequencing) foydalaniladi. «Plyus-minus» metodi.  «Plyus-minus» metodi birinchi marta 1975 yilda F.Senger va A.Koulson tomonidan taklif etilgan va fermentativ reaksiyalarga asoslangan. Bu usul genomning o’rganilayotgan qismiga mos keluvchi bir zanjirli DNK fragmentini ajratishni nazarda tutadi. Bu fragment keyinchalik polimeraza-ko’paytirish uchun matrisa sifatida foydalaniladi. Bunda praymer sifatida sintetik oligonukleotidlar yoki ma’lum restrikzalar yordamida gidrolizlangan tabiiy subfragmentdan foydalaniladi. «Plyus-minus» metodining bosqichlari: 1.Birinchi bosqichda DNK polimeraza yordamida 4 xil nukleotidlar ishtirokida polimerizasiya reaksiyasi amalga oshiriladi. Bunda bitta nukleotid radioaktiv nishonlangan bo’ladi.  O’rganilayotgan bir zanjirli DNK fragmentining to’liqsiz kopiyalari to’plamlarini olish maqsadida reaksiya cheklangan sharoitda o’tkaziladi. 2. Keyin polimerlar to’plami nukleotidlardan ajratiladi, aralashma 8 qismga ajratiladi va qo’shimcha polimerizasiya reaksiyalari davom ettiriladi. Qo’shimcha polimerizasiya reaksiyalari bitta nukleotid ishtirokisiz, 3 xil nukleotid ishtirokida («minus» sistema) yoki faqat bir xil nukleotid ishtirokida («plyus» sistema) o’tkaziladi. 3  xil nukleotid ishtirokida borayotgan reaksiyada («minus» sistema) matrisaga komplementar sintezlanayotgan barcha yangi zanjirlarda reaksiya aralashmada mavjud bo’lmagan eng yaqin nukleotidga borganda to’xtaydi. «Plyus» sistemada reaksiya aralashmada mavjud nukleotid joylashgan ketma-ketlikdan so’ng  to’xtaydi. 3. 8 ta namunadan olingan aralashma bir vaqtning o’zida yuqori aniqlikdagi elektroforezdan o’tkaziladi. Elektroforez geli radioavtografiya qilinadi va radioavtografiyadan nukleotidlar ketma-ketligi o’qiladi.  O’qilgan yakuniy ketma-ketlik dastlabki matrisaga komplimentar bo’ladi. Sengerning didezoksi-metodi. «Plyus-minus» metodining kamchiligi shundaki, 1-bosqichda aniq statistik kopiyalar tuplamlarni olish juda qiyin. Shu sababli 1977 yilda Senger boshchiligida yangi uslub ishlab chiqildi. Bu usul  didezoksinukleozidtrifosfatlar usuli deb nomlandi. Hozirgi vaqtda u Sengerning didezoksi-metodi nomi bilan yuritiladi. Bu usul asosida ham praymerning 3’-uchidan boshlanadigan DNK bir zanjirini polimeraza ishtirokida nusxasini olish yotadi. Polimerlanish reaksiyasi aralashmasida 4 xil nukleotidlar (dNTP) mavjud va ularning bittasi ³²R atomi bilan nishonlangan. Bundan tashqari aralashmaga nukleotidlarning sintetik analogi- 2’,3’-didezoksinukleozidtrifosfatlar (ddNTP) qo’shiladi. Bunda reaksiya terminasiyasi (to’xtashi) 2’,3’ didezoksinukleozidtrifosfatlar hisobiga amalga oshadi. DNK-polimeraza ddNTP DNK ning o’sib borayotgan zanjiriga ulash qobiliyatiga ega, lekin ddNTP zanjirga ulangandan keyin, zanjirning keyingi sintezi to’xtaydi, chunki ddNTP  3’-OH gruppaga ega emas. 4 ta probirkaga praymer eritmasi, 4 xil nukleodidlar dATP, dCTP, dGTP i dTTP saqlovchi aralashma (nukleotidlarning bittasi radiaktiv izotop bilan nishonlangan bo’ladi) va bir xil ddNTP solinadi. dNTP/ ddNTP konsentrasiyalari shunday tanlanadiki, reksiya determinasiyasi ddNTP ga komplimentar nukleotid mavjud har bir joyda sodir bo’lsin. 4 ta probirkadagi ddNTP 4 xil bo’lishi zarur. Senger metodi modifikasiyasi. Hozirgi vaqtda Senger metodining zamonaviy modifikasiyasi ham mavjud. Bunda didezoksinukleotidlar 4 xil fluoressent bo’yoqlar bilan nishonlanadi va bitta probirkada PSR o’tkaziladi. Keyin poliakrilamid gelidagi elektroforez vaqtida lazer nurlari gelning ma’lum qismlarida bo’yoqlar fluorisensiyasini qo’zg’aydi va detektor ayni vaqtda qaysi nukleotidning gelda migrasiya qilayotganligini aniqlaydi. Zamonaviy asboblar sekvinirlash uchun kapillyar elektroforezdan foydalanadi. Maksam-Gilbert metodi. Didezoksi-metod bilan birgalikda Maksam-Gilbert metodi ham keng qo’llaniladi. Bu metod A. Maksam va V.Gilbert tomonidan 1976 yilda taklif qilingan.  Bu usul yordamida DNK ning bitta yoki ikki zanjirini ham o’qish mumkin. O’rganilayotgan polinukleotid maxsus kimyoviy fragmentasiyaga uchratiladi. Boshlang’ich nuqtaga ega bo’lish uchun DNK fragmenti ³²R atomi bilan 5’-uchi yoki  3’-uchidan nishonlanadi. Ko’pchilik hollarda,fragment 5’-uchidan A4 fagining polinukleotidkinaza fermenti yordamida nishonlanadi. Bu ferment reaksiyada radioaktiv fosfatni DNK tarkibiga o’tkazadi. Agar DNK ning ikkita zanjiri ham o’qilishi zarur bo’lsa, bunday reaksiya ikkinchi zanjir uchun ham amalga oshiriladi.