Guruh talabasi ning biorganik kimyo fanidan amaliy mashg’uloti namangan 2023

3-MAVZU: HAYVON TO’QIMALARIDAGI DNK MIQDORINI ANIQLASH.
Kerakli asbob va reaktivlar: laboratoriya sentrifugasi, suv hammomi, shisha tayoqcha, Keldal kolbasi, 50 ml li o’lchov tsilindri, darajalangan o’lchov probirkasi, fotoelektrokolorimetr, probirka, shtativ, muz hammomi, NaON ning 1 n eritmasi, NaCl ning 20% li sirka kislotadagi to’yingan eritmasi, etil spirt, trixlor sirkaning 5% li eritmasi, kontsentrlangan sulfat kislota, 30% li vodorod peroksid, NaON ning 30% li eritmasi, universal indikator qog’oz, ammoniy molibdatning 5% li eritmasi, gidroxinonning 1% di eritmasi, karbonat sulfat aralashmasi, tarkibida 1 mkg/ml fosfor bor KH₂RO₄ ning standart eritmasi, jigar yoki taloq, perxlorat kislotaning 0,5 n eritmasi, Dishe reaktivi, 0,2 mg/ml kontsentratsiyali dezoksiribozaning standart eritmasi.
DNK A.S.Orlov va Ye.I.Orlova usuli bo’yicha miqdoriy jihatdan aniqlanadi. Bu usulning mohiyati shundaki, tekshiriladigan to’qima ishqoriy muhitda gidrolizlangandan keyin, NaCl ning sirka kislotadagi to’yingan eritmasi quyilganda oqsillar cho’kib, eritmada DNK va tarkibida fosfor bor boshqa moddalar qoladi. DNK ni boshqa fosforli birikmalardan spirt yordamida cho’ktirib, ajratib olinadi. To’qimadagi DNK miqdorini, undagi fosfor yoki dezoksiribozaga qarab aniqlash mumkin.
Ishning bajarilishi.
1-bosqich. Jigar yoki qora taloqni ishqor ta‘sirida gidrolizlash.
100 mg to’qima sentrifuga probirkasiga solinib, uning ustiga 1 ml 1 n NaON eritmasidan quyib, qaynab turgan suv hammomiga 15 minut quyiladi. Vaqti-vaqti bilan probirkadagi aralashma shisha tayoqchyaa bilan aralashtirib turiladi. Shu vaqt ichida to’qima to’la erib ketadi.
2-bosqich. Oqsillar va DNK ni cho’ktirish.
Gidrolizat asta-sekin avvalo xona temperaturasigacha, so’ngra muz yordamida 00S gacha sovitiladi. Uning ustiga NaCl ning 20% li sirka kislotadagi to’yingan eritmasidan 0,5 ml qo’shib, oqsil cho’ktiriladi. 5 minutdan keyin aralashma 5 minut minutiga 3000 marta aylanish tezligida sentrifugalanadi.
Sentrifuga probirkalaridan biriga 6 ml etil spirt qo’yib, sovitib qo’yiladi. Sovitilgan spirt ustiga sentrifugat (cho’kma ustidagi suyuqlik) qo’yiladi: bu vaqtda DNK cho’kadi, RNK va tarkibida fosfor bor boshqa birikmalar spirtli eritmada qoladi. DNK ni to’laroq cho’ktirish uchun, sentrifugalanganda olingan oqsil cho’kmasini 1 ml 1 n li NaON da (sovitilgan) eritiladi va tezda NaCl ning 20% li sirka kislotadagi to’yingan eritmasidan 0,5 mo qo’shib, qaytadan cho’ktiriladi. Aralashma 5 minut minutiga 5000 marta aylanish tezligida sentrifugalanadi. Sentrifugat birinchi DNK cho’ktirilgan spirli aralashmaga qo’yiladi. Probirkadagi suyuqlik yaxshilab aralashtirilgach, DNK ni to’laroq cho’ktirish uchun muz hammomiga 1 soat qoldiriladi. Bir soatdan keyin probirkadagi aralashma 5 minut yuqori tezlikda-minutiga 5000 marta aylanish tezligida sentrifugalanadi; sentrifugat to’kib tashlanadi. DNK cho’kmasi esa 2 marta 5% li trixlorsirka kislota bilan yuviladi. DNK miqdorini uning tarkibidagi fosforga yoki dezoksiribozaga qarab aniqlash mumkin.
3-bosqich. DNK ni fosfor bo’yicha miqdoriy aniqlash.
Ajratib olingan DNK kuydirilganda (minerallashtirish) fosfat erkin holatda ajraladi.
Qaytaruvchi ishtirokida fosfatni ammoniy molibdat bilan reaktsiyasida hosil bo’lgan molibden ko’kini kolorimetrik aniqlash mumkin, chunki rangning ravshanlik darajasi fosfor miqdoriga bog’liq bo’ladi. Trixlor sirka kislota bilan yuvilgan DNK batamom Keldal kolbasiga o’tkazilib, ustiga 1,5 ml kontsentrlangan sulfat kislota qo’shiladi va tiniq suyuqlik hosil bo’lguncha minerallashtiriladi. DNK ni kuydirishni tezlashtirish uchun 30% li vodorod peroksid qo’shiladi. Minerallashtirish tugagndan keyin Keldal kolbasidagi suyuqlik konussimon kolbaga o’tkazilib, 30% li NaON eritmasi yordamida (universal indikator bo’yicha) neytrallanadi. So’ngra suyuqlik 50 ml li o’lchov kolbasiga o’tkaziladi va belgi chiziqqacha distillangan suv qo’yib, hajmi 50 ml ga yetkaziladi.
Kolbadan 5 ml suyuqlik olib, 10 ml li darajalarga bo’lingan o’lchov probirkaga quyiladi, unga 5% li ammoniy molibdat eritmasidan 0,5 ml va 1% li gidroxinon eritmsidan 0,5 ml qo’shiladi. 5 minutdan keyin probirkaga 2 ml karbonat-sulfit aralashmasidan qo’shib, suv bilan umumiy hajm 10 ml ga yetkaziladi.
10 minutdan keyin rangli eritmaning optik zichligi fotoelektrokolorimetrda qitzil-svetofiltrda (600 nm) aniqlaniladi. Optik zichligi aniqlangach tekshirilayotgan ob‘ektdagi fosforning miqlorini kalibrlash egri chizig’i yordamida hisoblab topish mumkin.
Kalibrlar egri chizig’i chizish uchun 1 ml eritmada 1; 2; 3; 4 mkg fosfor bo’ladigan KH₂RO₄ ning standart eritmalari tayyorlanadi. Shu standart eritmalar bilan yuqoridagi rangli reaktsiya qilinib, ularning optik zichligi FEK da aniqlanadi. Absissa o’qiga standart eritmalarning kontsentratsiyasi, ordinata o’qiga optik zichlik (FEK ko’rsatkichi) qo’yiladi (22-rasm).
Tekshirilayotgan obektdan fosforga qarab DNK miqdorini quyidagi formula yordamida hisoblab topish mumkin:



bu yerda: a-kalibrlash egri chizig’i asosida topilgan fosfor miqdori (mkg); 50-minerallashtirilgan DNK ning umumiy hajmi (ml); 10,1-fosfor miqdorini DNK ga o’tkazish uchun koeffitsient; 5-rangli reaktsiya uchun olingan gidrolizat.
4-bosqich. DNK miqdorini dezoksiribozaga xos rangli reaktsiya asosida aniqlash.
Trixlorsirka kislota bilan yuvilgan DNK cho’kmasiga 0,5 n NaON eritmasidan 0,5 ml qo’yib, probirka og’zini uzun gaz o’tkazgich shisha naycha o’rnatilgan probirka (havo sovitkichi) bilan berkitib, qaynab turgan suv hammomiga 20 minut quyiladi. Sovitilgan gidrolizatdan 2 ml olib, uning ustiga 4 ml Dishe reaktivi qo’shiladi. Aralashma qaynab turgan suv hammomida 10 minut qizdiriladi, so’ngra sovitiladi. Aralashma barqaror ko’k rangga bo’yaladi. Rangning ravshanlik darajasi FEK da, qizil svetofiltr (600 nm) yordamida aniqlanadi. Zarurat bo’lsa, gidrolizat Dishe reaktivi –suv (2:1 nisbatdagi) bilan suyultiriladi. To’qimadagi DNK miqdori dezoksiriboza asosida tayyorlangan kalibrlash egri chizig’idan foydalanib, hisoblab topiladi.
Dezoksiriboza uchun kalibrlash egri chizig’i quyidagicha chiziladi: avval 1 ml da 0,04; 0,08; 0,12; 0,16; 0,2 mg dezoesiriboza bor standart eritmalar seriyasi tayyorlanib, Dishe reaktivi bilan rangli reaktsiya qilinadi. Aralashma rangining ravshanlik darajasi FEK da aniqlanib optik zichligi ordinata o’qiga, dezoksiriboza miqdori absissa o’qiga qo’yib chiqiladi va grafik chiziladi. (23 rasm).
________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________