Guruh talabasi ning biorganik kimyo fanidan amaliy mashg’uloti namangan 2023

1-tajriba. DNK nukleotid tarkibini qog’oz xromatografiya usulida aniqlash.
Ishning bajarilishi. 200-500 mg hayvon to’qimasidan ajratib olingan DNK preparati 2 marta 36% li etil spirtda yuvilgach, vakuum eksikatorda quritiladi. Quritilgan DNK 1-2 tomchi 70% li (yoki 56% li) perxlorat kislota eritmasida namlanadi va kavsharlangan ampulada, qaynab turgan suv hammomida 1 soat (agar 56% li perxlorat kislota ishlatilsa, ikki soat) gidrolizlanadi. Bunday sharoitda DNK erkin asoslargacha gidrolizlanadi. Ampula ochilib, gidrolizat kapilyar yordamida sentrifuga proirkasiga o’tkaziladi. Ampula devori juda oz miqdordagi distillangan suv bilan chayqaladi. Chayindi ham sentrifuga probirk5asiga quyiladi. Gidrolizat quyilgan probirkaga avval 2 tomchi 4 M kaliy gidroksid, so’ngra neytrallanguncha tomchilatib 1 M o’yuvchi kaliy eritmasi qo’shiladi. Shundan keyin kapillyar yordamida 1 tomchi kontsentrlangan xlorid kislota tomizib, 10 minut 2000-3000 ayl/min tezlikda sentrifugat keyingi xromatografik analiz uchun ishlatiladi.
2-tajriba. DNK gidrolizatini qog’oz xromatografiya usulida analiz qilish.
Gidrolizatni tarkibiy qismlarga ajratish uchun ishqoriy muhitli erituvchi sistema: n-butanol-suv-kontsentrlangan ammiak (60:10:0,1 nisbatda) ishlatiladi. Pastga oquvchi xromatografiya uchun «Leningradskaya medlennaya» («M») tipidagi qog’ozdan foydalaniladi. «Guvoh» modda sifatida 25-50 nonamol miqdorda nuklein kislota tarkibiga kiruvchi purin va piramidin asoslar tomiziladi. Tekshirilayotgan gidrolizatlar xromatogrammaga 0,05-0,1 ml hajmda tomiziladi, bu bitta dog’dagi «guvoh» modda sifatida tomizilgan asoslar miqdoriga to’g’ri keladi. Xromatografik ajralish protsessi 20-40 soat davom etadi. Azotli asoslarning qog’ozdagi lokalizatsiyasi ultraxemiskopda aniqlanadi. Asoslar start chizig’idan boshlab quyidagi tartibda joylashadi: guanin, tsitozin, 5-metiltsitozin, adenin, timin. Gidrolizatdagi asoslarni miqdoriy jihatdan aniqlash uchun xromatogrammadagi ultraxemiskop yordamida chegaralangan zonalar qirqib olinib 5 ml 0,1 n HCl eritmasida 37⁰S da, 12 soat davomida elyutsiya qilinadi. Kontrol sifatida qog’ozning azot asoslari tarqalmagan qismi qirqib olinib, bir xil sharoitda elyutsiya qilinadi. Elyuatlarning optik zichligi spektrofotometrning 1 sm li kyuvetalarida kontrolga qarshi quyidagi jadvalda berilgan to’lqin uzunliklarda aniqlaniladi:

26-jadval

isoblash uchun 27-javdval asosida optik zichlik ayirmasi, masalan, adenin uchun D=D₂₆₀-D₂₉₀ topilib, bu miqdorni hisoblash koeffitsientiga ko’paytirilsa, 5 ml elyuatdagi asosning mikromol miqdori kelib chiqadi.

______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________