Leyla Alı qızı Mehdibəyli
Yüklə 1,34 Mb. Pdf görüntüsü
|
|
Reseptor
İnsan geni Struktur Aqonistl ər Antoqonistl ər Terapevtik h ədəf 5HT 2A 13q14
– q21
GPCR bufotenin, ergonovine, lisuride, LSD, mescaline, myristicin, psilocin, psilocybin, yohimbine aripiprazole, clozapine, cyproheptadine, eplivanserin, etoperidone, iloperidone, ketanserin, methysergide, mirtazapine, nefazodone, olanzapine, quetiapine, risperidone, ritanserin, trazodone, ziprasidone Depressiya Narahatlıq Şizofreniya D ərketmə Qidalanma Yuxu pozulması 5-HT
2A - nın strukturunda və funksiyasında anormallıq şizofreniya, depressiy a/narahatlıq və narkotik asılılığı da daxil olmaqla, bir sıra xəstəliklərlə əlaqələndirilir. Bundan əlavə, bir çox halüsinogen dərmanlar 5-HT 2A üçün aqonist kimi f əaliyyət göstərərək psixoaktiv effektlər verir. Farmakoloji t ədqiqatlar göstərir ki, 5-HT 2A -n ın yüksək yaxınlıqlı antoqonistləri atipik antipsixotikl ərdir, çünki onlar şizofreniyanın müsbət və mənfi əlamətlərini azaltmaq üçün effektiv t əsir göstərirlər [87]. 5-HT 2A
əşdirilməsi ACTH, kortikosteron, oksitosin, renin və prolaktin sekresiyasının stimullaşdırılmasına gətirib çıxarır. 5-HT 2A reseptorunun inhibirl əşməsi isə davranışa təsir göstərir. Şizofreniyanın müalicəsində müxtəlif reseptora bağlanma yaxınlığı olan 5-HT 2A antaqonistl əri (risperidon, ritanserin, serokel, olanzapin v ə s.) istifadə olunur [40].
37
1.5.2. 5-HT 2A reseptor geninin polimorfizmi v ə xəstəliklər arasında əlaqə 5HT
2A
reseptorunu kodlaşdıran 5-HT2A geni, 13q14-q21 lokalizasiyada yerl əşir və siçovul, siçan, insanlarda 471 amin turşu ardıcıllığını kodlaşdırır. Bu gen 2 intronla ayr ılmış 3 ekzondan ibarət olub, ölçüsü 20 kb-dən çoxdur. 5- HT2A geni bir çox polimorfizml ərə malikdir. İnsan 5-HT2A reseptor geninin kodlaşdırma bölgəsində ən azı yeddi tək nukleotid polimorfizmi aşkar ol unmuşdur. Bu polimorfizmlərdən beşi (T25N, I197V, S421F, A447V və H452Y) amin turşu ardıcıllığında dəyişikliklərə gətirib çıxarır. Yeddi tək nukleotid polimorfizminin qalan ikisi (T102C v ə C516T) isə 5-HT 2A reseptorunun amin turşu ardıcıllığını dəyişdirmir [12]. 5-HT2A-
nı əhatə edən çoxsaylı tədqiqat işinin mərkəzində yer alan bir polimorfizm, kodon 102-d ə (T/C, rs6313) tək nukleotid polimorfizmdir (SNP). Bu polimorfizmd ə, 5-HT2A-nın kodon 102-də timin (T) və ya sitozin (C) əsası ola bil
ər. 5-HT2A kodon 102 polimorfizmi, 5-HT 2A reseptor pro teininin amin turşu ardıcıllığının dəyişdirilməsinə gətirib çıxarmır, belə ki, hər iki allel 34-cü mövqed ə serin amin turşusunu kodlaşdırır [79]. Eyni zamanda pomotor sah əsinin 1438-ci mövqeyində, 5-HT2A-nın 102 T/C polimorfizmi ilə güclü əlaqə qeyri-b ərabərliyinə malik olan, G-A dəyişikliyi də qeydə alınmışdır (A-1438G (rs6311)) [35]. Son ill
ərdə çoxsaylı molekulyar genetik tədqiqatlar serotonin sisteminə yön
əldilmişdir və bu sistemin intihar davranışının, aqressiyanın patogenezində rol oynamas ı irəli sürülmüşdür. Biopsi tədqiqatları, qismən müvafiq genlərin ekspressiyasına təsir edən funksional polimorfizmlər səbəbi ilə, kontrol iştirakçılar ilə müqayisədə intihar qurbanlarının beynində daha az serotonin transporter bağlanma sahələrinin olmasını və serotonin 2A (5-HT 2A ) reseptorlarının daha çox ekspressiyasının olmasını bildirmişdir [71]. 38
Lin v ə əməkdaşları, Böyük Britaniya və Yapon populyasiyasını əhatə edən t ədqiqat işlərində, 13q14-q21 lokalizasiyası və şizofreniya arasında əlaqə olmasını təklif etdilər [56]. Bundan sonra, 5HT reseptor geninə malik olan xromosomun bu hiss əsi bir neçə tədqiqatçının diqqət mərkəzinə çevrildi və bu lokusun, serotonergik sistemin müxt əlif neyroendokrin funksiyaları, habelə depressiya, naraha tlıq və yorğunluğu tənzimləməsini təmin etməsi təklif olundu. Sonrakı cəhdlər çoxsaylı neyropsixiatrik xəstəliklərin patogenezində eyni gen lokusundan (5-HT2A) olan iki t ək nukleotid polimorfizmlərinin (rs6311 və rs6313) mümkün əlaqəsinə dair məlumatlar vermişdir. Promotor hissəsində SNP-nin (rs6311), genin promotor f əaliyyətinə təsir göstərdiyi müəyyən edilmişdir. Promotor f əaliyyətinin çatışmazlığının (rs6311-də) bir neçə populyasiya arasında şizofreniya da daxil olmaqla, neyropsixiatrik xəstəliklərə səbəb olmağı t əklif edilmişdir. Lakin, nəşr olunan bir çox tədqiqatlara baxmayaraq, indiyədək əldə edilən nəticələr müxtəlif olmuşdur. Ruslar, Tatarlar və Başqırdları əhatə ed ən analiz, rus əhalisində rs6311-dəki genotip tezlikləri ilə şizofreniyada arasında əhəmiyyətli əlaqənin mövcud olmasını qeyd etdi, lakin Tatarlar və Başqırdlarda SNP ilə şizofreniya arasında əhəmiyyətli bir əlaqə göst ərilməmişdir. Rs6313-ü əhatə edən bir tədqiqatda, Şərqi Asiya və Avropa əhalisi arasında əhəmiyyətli allelik heterogenliyin olduğu aşkar edilmişdir. Belə ki, Çin, Yapon, Sinqapur v ə Koreya populyasiyaları da daxil olmaqla, Şərqi Asiya
əhalisində, T alelinin yayılması ilə əlaqədar olaraq SNP (rs6313) və şizofreniya arasında əlaqə olduğu qeyd olunur. Ancaq bəzi digər tədqiqatlarda, C v ə ya T allelinin (rs6313) ekspressiyası və xəstəlik arasında heç bir əlaqə tapılmamışdır [75]. Şizofreniyada serotonin reseptorlarının rolu, bəzi antipsixotik dərmanların serotonin reseptorlarına təsir etməsi və bəzi serotoninə bənzər molekulların (m əsələn, D lysergic aciddiethylamide (LSD)) qabarıq psixogenetik təsirlərə sahib olmasına görə önə sürülmüşdür. T102C polimorfizmini psixiatrik 39
diaqnozlar v ə əlaqəli şəxsiyyət fenotipləri ilə əlaqələndirən bəzi sübutlar mövcuddur. Bir meta-analizd ə T102C polimorfizminin C alleli və şizofreniya arasında əlaqə olduğu göstərilmişdir. Serotonin dopaminergik neyronları modulyasiya etdiyin ə görə, serotonin reseptor geninin polimorfizminin şizofreniya xəstələrində klinik xüsusiyyətlər və spesifik idrak funksiyaları ilə əlaqələndirilməsi mümkündür [82]. Baxmayaraq ki, rs6313 və rs6314-ün bioloji mexanizmi aydınlaşdırılmamışdır, tədqiqatlar hər iki polimorfizmin şizofreniya riski üçün namiz əd olduğunu göstərməkdədir [18]. Qeyd etm ək lazımdır ki, bir sıra tədqiqatlarda rs6313 ilə şizofreniya arasında əlaqənin olması qeyd edilmiş [6,50], bəzilərində isə əlaqə tapılmamışdır [7,86]. Daha zəif idrak funksiyasının rs6313-nin T-alleli ilə əlaqəli olduğu təsbit edilmişdir [79]. Ancaq başqa bir araşdırmada daha zəif vizual diqq ətin C-alleli ilə əlaqəli olduğunu təsbit edilmişdir [82]. Bu fərqli nəticələr, iki araşdırma arasındakı əhəmiyyətli etnik fərqliliklər nəticəsində ola bilər.
Araşdırmalarda 5-HT 2A polimorfizml ərinin, şizofreniyada xüsusilə də, icra funksiyası, yaddaş və diqqət funksiyasına təsiri araşdırılmışdır. Üçok və əməkdaşları, şizofreniya xəstəsi olan 82 nəfərdə TT və CC homoziqot qruplarla müqayis
ədə, TC genotipinin davamlı diqqət və dalğınlıq ilə bağlı daha aşağı performans il ə əlaqədar olduğunu bildirmişdir [79]. T102C CC genotipinin şizofreniyada yüksək tezlikdə olması bildirilir və buna görə də sıx maraq doğurur. Bununla belə, 5-HT 2A - nın diqqət prosesləri üzrə spesifik rolu aydın şəkildə müəyyən edilməmişdir və daha aydın izah tələb edir [82]. C-allel formas ının həm sağlam kontrol nümunələrində, həm də şizofreniya x əstələrində 5-HT2A-nın T allelindən daha az funksional olduğunu göstərən bəzi sübutlar var v ə şizofreniya xəstələrində bu fərq daha da qabarıqdır [19]. DNT metill əşməsinin şizofreniyada əhəmiyyətli epigenetik mexanizm ol duğu düşünülür, çünki 5-HT2A DNT metilləşməsinə ətraf mühit təsirləri ilkin nevroloji n əticələrlə əlaqələndirilir. 5-HT2A üçün, DNT metilləşməsinin 40
əksəriyyəti promotor və I ekzon daxilində baş verir, lakin genin digər bölg ələrində də çox az DNT metilləşməsi fəaliyyəti vardır. 5-HT2A CpG sahələri, şizofreniya xəstələrinin prefrontal korteksində hipermetilləşmiş (promotor bölg
ənin -1438-ci mövqeyində, rs6311-ə yaxın) və ya hipometilləşdirilmişdir (I ekzonun 102-ci mövqeyind ə, rs6313-ə yaxın), bu da potensial olaraq, şizofreniya xəstələrində zəif 5-HT2A ekspressiyasına səbəb olur. İntihar meyli olan əsas psixoz xəstələrində periferik leykositlərdə rs6313-də DNT metill əşməsinin artması bildirilmişdir. DNT metilləşməsinin 5-HT2A mRNT ekspr essiyasını dəyişdirməsinin aydın olmasına baxmayaraq, 5-HT2A polimorfizm inin mRNT ekspressiyasına da təsir göstərdiyi və bəlkə də CpG saytlar ının tanınmasını dəyişdirməsi bildirilmişdir [18]. Bir araşdırmada promotor DNT metill əşməsinin təsirləri nəzərə alınmayaraq, 5-HT2A rs6314-ün mRNT ekspressiya d əyişiklikləri ilə əlaqəli olduğu təsbit edilmişdir [13]. Şizofreniya üçün dərman müalicəsi, əsasən, proksimal molekulyar h ədəfləri dopamin (DA) və serotoninin G zülalla əlaqəli reseptorları olan tipik və atipik antipsixotik d ərmanlardan ibarətdir. Tipik antipsixotik dərmanlar (məsələn, xlorpromazin, haloperidol v ə flufenazin) güclü DA D2 reseptor blokadasını nümayiş etdirir və şizofreniyanın pozitiv simptomlarını effektiv şəkildə müalicə ed ərkən, atipik antipsixotik dərmanlar (məsələn, klozapin, olanzapin, ketiapin, (serotonin resep torları, xüsusilə 5-HT2A üçün yüksək uyğunluğa malikdir)) isə şizofreniyanın müsbət və mənfi əlamətlərini effektiv şəkildə müalicə edir. Kliniki t ədqiqatlar göstərir ki, atipik antipsixotik dərmanları qəbul edən şizofreniklərin d ərmanlara qarşı reaksiyalarında geniş dəyişkənlik nümayiş olunur. Əslində, şizofreniklərin 30-60%-i və müalicəyə davamlı olan əsas depressiyalı şəxslərin 10-65%-i atipik antipsixotikl ərlə müalicədən sonra yaxşılaşmır; digərləri isə h əyati təhlükəli ola biləcək yan təsirlər yaşayır [20]. 5-HT 2A - nın quipazin və 3-triflüorometilfenilpiperazin də daxil olmaqla, reseptor aqonistl ərinin bağlanması yolu ilə prefrontal idraka təsir göstərdiyi
41
mü əyyən edilmişdir [32]. Prefrontal idrak funksiyasındakı çatışmazlıqlar (m əsələn, icraçı rollar və işçi yaddaş) şizofreniyanın əsas xüsusiyyətidir. Farmakoloji v ə ekspressiya tədqiqatlarına əsaslanaraq, nəticələr susdurulmuş 5- HT2A mRNA ekspressiyasının, reseptor sıxlığının və ya fəaliyyətinin azal
masının şizofreniya ilə əlaqəli olduğunu göstərir [18]. Maple v
ə başqaları stresə bağlı 5-HT2A ekspressiyasının adaptasiya f unksiyası olduğunu və şizofreniya xəstələrində pozulduğunu irəli sürmüşdür. Sağlam fərdlərdə 5-HT2A-nın artan ekspressiyasına işarə edən sübutların əksəriyyəti ilə yanaşı, 5-HT2A-nın induksiya olunmuş ekspressiyasının faydalı olmasına baxmayaraq, antipsixotiklərin 5-HT2A-nın fəaliyyətinə maneə tör
ətməsi paradoksaldır [58]. Bu paradoks halüsinogenlərin (məsələn, lysergic acid diethylamide) 5-HT2A- nın aqonisti, atipik antipsixotiklərin isə antaqonistlər olması ilə daha da vurğulanır. İnsan 5-HT2A genindəki polimorfizmlər dəyişən yaddaş prosesləri ilə əlaqələndirilir. M əsələn,
reseptordakı His452-
nin tirozin
qalığı ilə
d əyişdirilməsinə səbəb olan 5-HT2A gen polimorfizmi, yetkinlər arasında ya ddaşın bərpasında əhəmiyyətli pozulma ilə əlaqələndirilir. Şizofreniklər və sağlam kontrol arasında, 5-HT2A gen polimorfizmlərinin homoziqot CC (T102C) v ə GG (A-1438G) və ya T-allelin (rs6314) daşıyıcıları, əhəmiyyətli dərəcədə p ozulmuş qısa müddətli verbal yaddaş nümayiş etdirirlər [87]. 5-HT- nin yaddaşla əlaqəsi məməlilər arasında ümumiləşdirilir: belə ki, triptofan beyin 5-HT s əviyyələrini artırır və gəmiricilərdə, yaşlılarda, alzeimer x əstələrində və şizofreniyada yaddaşı artırır. Bundan əlavə, kəskin və ya xroniki triptofan tük ənməsindən sonra beyin 5-HT konsentrasiyalarının azalması ilə, siçanlarda qorxu yaddaşının, siçovullarda obyekt yaddaşının və insanlarda nəqli yaddaşın pozulması göstərilmişdir [87]. 42
EKSPERİMENTAL HİSSƏ II FƏSİL. TƏDQİQATIN MATERİAL VƏ METODLARI 2.1. T
ədqiqat obyektinin xarakteristikası Serotonin sisteminin 5-HTT v ə 5-HT2A genlərinin polimorfizminin yoxlanılması məqsədilə aparılan işlərdə tədqiqat materialı kimi, ilk olaraq, Bakı şəhəri 2 saylı Kliniki Psixiatriya Xəstəxanasından razılıq əsasında alınmış qan nümun
ələrindən ayrılmış xromosom DNT-si istifadə olunmuşdur. 2 saylı Kliniki Psixiatriya X əstəxanasından əksəriyyəti şizofreniya paranoid forma olmaqla, obsessiv-kompulsiv x əstəlik, sui-qəsd cəhdləri, dissosiv–konversiv pozuntu, baş beyin x
əstəliyi və s. kimi psixoloji xəstəlikləri olan 30 nəfərdən qan nümunələri toplanmışdır. T ədqiqatda kontrol nümunələr olaraq, AMEA Molekulyar Biologiya və Biotexnologiyalar İnstitutunun müxtəlif elm sahələri ilə məşğul olan 24 nəfər əməkdaşından qan nümunələri götürülmüşdür. Eyni zamanda, 5-HTT v ə 5-HT2A genlərinin polimorfizminin müxtəlif idman sah ələrində fəaliyyət göstərən idmançılarda paylanmasının tədqiq edilm
əsi də həyata keçirilmişdir. Bu məqsədlə, Azərbaycan Dövlət Bədən T ərbiyəsi və İdman Akademiyasından əksəriyyəti futbolçular olmaqla, ağır atletika, sambo, karate kimi müxt əlif idman sahələrində fəaliyyət göstərən, 28 n əfər gənc idmançıdan razılıq əsasında qan nümunələri toplanmışdır. Qeyd etm ək lazımdır ki, qan nümunələrinin toplanması beynəlxalq bioetika qanunlarına əsasən təcrübəli tibb bacıları tərəfindən steril şəraitdə aparılmış, bu normalara müvafiq olaraq donorların anonimliyi qorunmuş və nümunələr yalnız t ədqiqat məqsədləri üçün istifadə olunmuşdur. 43
2.2. Qan nümun ələrindən nüvə DNT-nin ayrılması Qan nümun ələrindən DNT-nin ayrılması məqsədilə Rusiya Federasiyası “Izogen” laboratoriyasının istehsal etdiyi “Diatom TM
istifad ə olunmuşdur. Müvafiq qaydada işarələnmiş qan nümunələrindən xromosom DNT-sinin ayr ılması üçün proses istehsalçının təlimatı əsasında aşağıdakı mərhələlər üzrə həyata keçirilmişdir: 1)
İlk mərhələdə lizis prosesinin həyata keçirilməsi üçün əvvəlcədən nomr
ələnmiş sınaq şüşələrinə 800 mkl Lizis Buferi tökülmüş və uyğun şəkildə hər bir sınaq şüşəsinin üzərinə qan nümunələrindən 200 mkl əlavə edilmişdir. Sınaq şüşələri 5-10 dəfə çevirməklə qarışdırılaraq termostata yerl əşdirilmişdir. 2)
Qarışıq termostatda 65ºC temperaturda 5-7 dəq müddətində saxlanılmışdır. Qeyd etmək lazımdır ki, lizis prosesinin tam olaraq getm əsi üçün, sınaq şüşələri termostatda olarkən bir müddət sonra hər bir sınaq şüşəsi çevirməklə qarışdırılıb, yenidən termostata yerl
əşdirilmişdir. 3) Termostatdan sonra h ər sınaq şüşəsindəki qarışığın üzərinə 40 mkl NukleosS sorbentinin homogen suspenziy ası əlavə edilmişdir. Suspenziya əlavə edilməmişdən qabaq tam homogen vəziyyətə g ətirilənə qədər intensiv şəkildə qarışdırılmışdır. 4) Sorbent əlavə olundurdan sonra sınaq şüşələri rotatora yerləşdirilərək 20-30 dövr/d əq sürətlə 10 dəq müddətində qarışdırılmışdır. Bundan sonra sınaq şüşələri 5000 dövr/dəq sürətlə 10 san ərzində sentrifuqalaşdırılmışdır. 5) Nümun ələrin sentrifuqalaşdırılmasından sonra, sınaq şüşələrinin dibind ə yaranan çöküntüyə toxunmadan supernatant ehtiyatla su şırnağı nasosu vasitəsi ilə kənarlaşdırılmışdır. 44
6) Sınaq şüşələrində qalan çöküntünün üzərinə 400 mkl Lizis Buferi əlavə edil
ərək vorteksd
ə homogen
v əziyyət
əldə edil
ənə q ədər qarışdırılmışdır. Daha sonra hər bir sınaq şüşəsinin üzərinə 1 ml işçi Duz buferi əlavə edilmiş və vorteksdə qarışdırılmışdır. Vorteks edildikd
ən sonra qarışıq 10 san ərzində 5000 dövr/dəq sürətlə se ntrifuqalaşdırılmışdır. Eyni qayda ilə (bənd 5) supernatant k ənarlaşdırılmışdır. 7) Yenid ən sınaq şüşələrində qalan çöküntünün üzərinə 1 ml işçi Duz Buferi əlavə edilərək qarışıq vorteksdə homogenləşdirilmiş, daha sonra 10 san ərzində 5000 dövr/dəq sürətlə sentrifuqalaşdırılmış və supernatant k ənarlaşdırılmışdır. 8) (7 ) saylı bənd təkrar edilmişdir. 9) N əhayət, Yuma proseslərindən sonra alınan çöküntü 65 o C-d
ə 3-4 dəq ərzində termostatda qurudulmuş və üzərinə 200 mkl ExtraGene E əlavə edilmişdir. Daha sonra qarışıq vorteksdə homogen vəziyyətə gətirilərək ardınca termostatda 65ºC-də 4-5 dəq ərzində saxlanılmışdır. 10) Q arışıq vorteksdə bir daha qarışdırılaraq, sonda 1 dəq 10000 dövr/d əq sürətlə sentrifuqalaşdırılmışdır. 11) Bundan sonra çöküntüy ə toxunmamaq şərti ilə supernatantlar ehtiyatla götürül ərək əvvəlcədən nömrələnmiş təmiz sınaq şüşələrinə keçirilm işdir. Sonda ayrılmış DNT-lər isə –20ºC-də saxlanılmışdır.
2.3. DNT-nin t əmizlik dərəcəsinin və qatılığının spektrofotometrik yolla t əyini Qan nümun ələrindən ekstraksiya edilmiş DNT nümunələrinin qatılığı və t əmizlik dərəcəsi spektrofotometriya metodu ilə yoxlanılmışdır. Bunun üçün Epoch Microplate Spectr ophotometr cihazında, Gen5 proqramının köməyi ilə 45
260 v ə 280 nm dalğa uzunluqlarında DNT nümunələrinin optik sıxlıqları ölçülür. Düzgün ekstraksiya olunmuş və PZR üçün yararlı olan DNT nümunələri üçün optimal t əmizlik dərəcəsi 1,8≤ [D260/D280] ≥2 təşkil edir. Ekstraksiya edilmi ş DNT-nin qatılığı 260 nm dalğa uzunluğunda ölçülmüş optik sıxlığa əsasən təyin edilir. Həm DNT, həm də RNT 260 nm dalğa uzunluqlu işığı udur. Bunun üçün "NanoDrop" spektrofotometrin qabında birinci xanaya kontrol kimi 2 μl ExtraGene E məhlulu, digər xanalara isə 2 μl ekstrak siya edilmiş DNT nümunələri əlavə olunur və optik sıxlıqları ölçülür. Spektrofotometrd ə 280 nm dalğa uzunluğunda da ölçmə aparılır ki, bu nöqtə zülallar üçün pik nöqt ədir. Zülallar, fenol, duzlar və digər çirkləndiricilər düzgün qiym ətlərə təsir edib, xəta yaradır. Eyni zamanda 320 nm dalğa uzunluğunda da ölçülm ə baş verə bilər, çünki nuklein turşuları və zülallar bu dalğa uzunluqlu işığı udmur. DNT-nin m əhluldakı qatılığı aşağıdakı düstur əsasında hesablanılır:
Yüklə 1,34 Mb. Dostları ilə paylaş:
|