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PRODUÇÃO DE ETANOL DE SEGUNDA GERAÇÃO
POR Zymomonas mobilis NATURALMENTE
OCORRENTE E RECOMBINANTE, EMPREGANDO
BIOMASSA LIGNOCELULÓSICA
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RIENTADOR
:
Prof. Nei Pereira Jr,
PhD
Universidade Federal do Rio de Janeiro
Escola de Química
2012
Universidade Federal do Rio de Janeiro
Escola de Química
Programa de Pós-Graduação em
Tecnologia de Processos Químicos e
Bioquímicos
ii
PRODUÇÃO DE ETANOL DE SEGUNDA GERAÇÃO POR
Zymomonas mobilis NATURALMENTE OCORRENTE E
RECOMBINANTE, EMPREGANDO BIOMASSA
LIGNOCELULÓSICA
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Tese de Doutorado apresentada ao Programa de Pós-Graduação
em Tecnologia de Processos Químicos e Bioquímicos para a
Obtenção do Grau de Doutor em Ciências ( DSc)
Universidade Federal do Rio de Janeiro
Escola de Química
2012
iii
PRODUÇÃO DE ETANOL DE SEGUNDA GERAÇÃO POR
Zymomonas mobilis NATURALMENTE OCORRENTE E
RECOMBINANTE, EMPREGANDO BIOMASSA LIGNOCELULÓSICA
Danielle da Silveira dos Santos
Tese submetida ao Programa de Pós-graduação em Tecnologia de Processos
Químicos e Bioquímicos da Escola de Química da Universidade Federal do Rio de
Janeiro, como parte dos requisitos necessários à obtenção do grau de Doutor em
Ciências, sob orientação do Prof. Nei Pereira Jr.
Banca examinadora:
Prof. Nei Pereira Junior, PhD (EQ/UFRJ)
(Orientador-Presidente)
Prof
a
. Janete Magali de Araújo, DSc (CCB/ UFPE)
Prof. Antonio Carlos Augusto da Costa, DSc (IQ/ UFRJ)
Prof
a
. Eliana Flávia Camporese Sérvulo, DSc (EQ/UFRJ)
Prof. Rodrigo Pires do Nascimento, DSc (EQ/UFRJ)
Prof
a
. Lídia Maria Melo Santa Anna, DSc (PETROBRAS)
EQ/UFRJ 2012
iv
F
IC HA C AT ALOGR ÁF IC A
Santos, Danielle da Silveira
dos
.
Produção de etanol de segunda geração por Zymomonas mobilis
naturalmente
ocorrente
e
recombinante,
empregando
biomassa
lignocelulósica/ Danielle da Silveira
dos
Santos. -- Rio de Janeiro, 2012.
Tese (Doutorado em Tecnologia de Processos Químicos e
Bioquímicos)
–
Universidade Federal do Rio de Janeiro, Escola de
Química, Rio de Janeiro, 2012.
218 p.: il.
Orientador: Nei Pereira Jr., PhD.
1. Zymomonas mobilis. 2.Fermentação. 3.Bagaço de cana-de-açúcar.
4. Engenharia genética. 5. Teses
I. Pereira Jr., Nei (Orient.). II. Universidade Federal do Rio de Janeiro,
Escola de Química, Pós-Graduação em Tecnologia de Processos
Químicos e Bioquímicos. III. Título.
v
A meus pais, Maria Ignês e José Fernando, à minha irmã, Vanessa, ao meu
afilhado, João Guilherme, aos meus avós e ao meu amor, Bruno.
Dedico esta Tese a vocês, que são tudo em minha vida.
vi
“A cada dia que vivo, mais me
convenço de que o desperdício da
vida está no amor que não
damos, nas forças que não
usamos, na prudência egoísta
que nada arrisca.”
Carlos Drummond de Andrade
vii
AGRADECIMENTO ESPECIAL
Ao querido professor Nei Pereira Jr., obrigada pela orientação exemplar,
pautada por um elevado e rigoroso nível científico, contribuindo para enriquecer
todas as etapas subjacentes ao processo de investigação. Obrigada pela
confiança depositada, pela oportunidade oferecida, pela partilha do saber, por
estimular o meu interesse pelo conhecimento, pelo acompanhamento
incansável nesta jornada, me encorajando para que eu prosseguisse e
concluísse este trabalho. Orgulho-me de ter desenvolvido este estudo sob a
sua orientação. Acima de tudo, obrigada por ter sido responsável pelo meu
amadurecimento profissional. Jamais teria ido tão longe sem o seu auxílio,
amizade e dedicação. Meu profundo respeito, admiração e gratidão.
viii
AGRADECIMENTOS
Agradeço principalmente ao meu amado Deus, que com seu amor
incondicional e sua imensa graça tem me dado forças para enfrentar todos os
obstáculos da vida, permitido que eu realize todos os meus sonhos.
À minha família, da qual sempre tive apoio total e um amor incondicional:
meus pais, José Fernando e Maria Ignês; minha irmã, Vanessa; meu sobrinho,
João Guilherme; meu cunhado, Mario; meus avós, Geraldo, Isaura, Maria
Clara, Luís Fernando, Neide e Nyldo, que sempre estiveram presentes em
minha vida, me dando apoio e me erguendo em qualquer situação; a meus
primos e tios, em especial, Walter Silveira, pelo auxílio e carinho. Minha
felicidade não se realizaria sem a participação de vocês.
A meu futuro marido, Bruno Moreira Martins, por ser o meu porto seguro e
anjo da guarda em todos os aspectos da minha vida, por todo amor, dedicação,
carinho e conforto em todos os momentos. Com toda a certeza, se não
estivesse do seu lado não seria tão feliz e completa. Agradeço também à sua
família, pela convivência agradável e carinho.
Ao Professor Dr. Fernando Araripe Torres (IB, UnB), pela dedicação,
profissionalismo e grande colaboração depositada; assim como ao seu grupo
de pesquisa; em especial, Viviane. Meus sinceros agradecimentos.
A todos os integrantes do Laboratório de Desenvolvimento de Bioprocessos
pelo auxílio e companheirismo, tornando o laboratório um lugar agradável:
Liliana, Patrycia, Sabrina Dias, Mariana Ruiz, Vanessa Rocha, Fabrício, Luís
André, Paulo, Mariana Faber, Mônica, Camylle, Leonard, Beatriz, Guilherme,
Vanessa, Renata, Lys, Ludmilla, Sabrina Mesquita, Mariana Mello, Elisabete e
Eleandro, Wilma, Marcio, Carla; ao Jorge, pela colaboração e atenção em
todos os momentos.
Às queridas alunas, Aghata e Jéssica, pelo auxílio, amizade e carinho.
ix
Ao Luís Carlos por ter sido fundamental na elaboração da minha tese, por
todo apoio, estímulo, amizade, dedicação e confiança a mim depositadas. Não
tenho palavras que descrevam tamanha gratidão.
À Carolina e Maeda, pela colaboração neste trabalho, auxílio, amizade e
companheirismo.
Ao meu melhor amigo, Elcio, pela presença em todos os momentos,
contribuindo efetivamente para formulação de minha tese, por todo carinho,
dedicação e amizade depositados.
À Dona Edina, que já faz parte da família, por todo o carinho, amor e
companheirismo.
Às minhas melhores amigas, Bárbara, Ticiane, Regianne, Alessandra,
Daiane, Camila e à nova amiga, Janaína, pelo companheirismo, carinho,
momentos de descontração, desabafo e pela amizade sincera.
Ao Professor Dr. Donato Aranda, pelo auxílio e amizade, assim como os
integrantes de seu grupo de pesquisa; em especial às queridas amigas, Ana
Paula, Andréia, Mariana Barreto e Laiza; e ao amigo Dower, pelo
companheirismo e confiança depositados.
Ao Programa de Pós-graduação em Tecnologia de Processos Químicos e
Bioquímicos da Escola de Química da UFRJ; ao Departamento de Engenharia
Bioquímica, especialmente aos funcionários da Secretaria de Pós-graduação
da Escola de Química, pela agradável recepção e convivência diária.
À PETROBRAS, CNPq e FAPERJ pelo apoio financeiro.
Aos membros da banca, por terem aceitado a participar da avaliação deste
trabalho.
"A glória da amizade não é só a mão estendida, o sorriso carinhoso
nem mesmo a companhia. É a inspiração espiritual que vem quando você
descobre que alguém acredita e confia em você”.
Anônimo.
E a todos que participaram direta ou indiretamente na realização deste trabalho,
Muito Obrigada!
x
RESUMO
SANTOS, Danielle da Silveira dos. Produção de etanol de segunda geração por
Zymomonas mobilis naturalmente ocorrente e recombinante empregando
biomassa lignocelulósica. Orientador: Nei Pereira Jr. Escola de Química-
Universidade Federal do Rio de Janeiro, 2012.
O desenvolvimento de tecnologias para produção de bioetanol a partir de materiais
lignocelulósicos mostra-se promissor devido às várias vantagens da utilização de biomassa
residual para produção de etanol de segunda geração. Dessa forma, o atual cenário dos
biocombustíveis pode ser contemplado com mais uma alternativa tecnológica, pois o bagaço
de cana-de-açúcar, principal material lignocelulósico em países tropicais, possui enorme
potencial energético. A bactéria Zymomonas mobilis mostrou-se extremamente atraente
para a produção de etanol combustível de segunda geração a partir da glicose proveniente
da fração celulósica, em virtude de sua elevada capacidade de absorção, resultando em
altos valores de produtividade. No entanto, as linhagens nativas mostraram-se incapazes de
metabolizar outro açúcar importante encontrado nas biomassas de composição
lignocelulósica, a xilose oriunda da fração hemicelulósica. Visando avançar neste tema e
tornar a produção de etanol de segunda geração mais eficiente, recomendou-se a
incorporação de técnicas da Biologia Molecular, a fim de dotar as linhagens utilizadas no
presente estudo capazes de fermentar também a xilose. Com isto, motivados com a procura
de novas alternativas energéticas e industriais, nas quais diferentes derivados de petróleo
sejam substituídos, avançar-se-ia para a concepção SSCF. Desta forma, o objetivo deste
trabalho consiste em avaliar a produção de etanol a partir do bagaço de cana por
Zymomonas mobilis, utilizando-se a estratégia de processo SSF (hidrólise enzimática e
fermentação simultâneas) e SSCF (hidrólise enzimática e co-fermentação simultâneas) a
partir da linhagem nativa e recombinante, respectivamente. Inicialmente, para se conseguir
o fácil acesso das enzimas do complexo celulásico até a celulose, o bagaço passou por um
pré-tratamento ácido para extração dos açúcares da fração hemicelulósica, resultando em
um resíduo sólido denominado celulignina. Em seguida, foi realizado um pré-tratamento
alcalino, que promove sua deslignificação parcial. Inicialmente, a celulose presente na
celulignina parcialmente deslignificada foi pré-hidrolisada com enzimas de um complexo
enzimático comercial denominado celulases, permitindo a conversão da celulose a açúcares
fermentáveis, nas temperaturas de 50°C, durante 12 horas. No que tange à transformação
genética aplicada em Z. mobilis, o plasmídio pZMO1 (1565 kb) foi sintetizado quimicamente,
contendo os genes relacionados à origem de replicação de E. coli e de Z. mobilis, os genes
que codificam as enzimas XI, XK, TAL e TKL, bem como a marca de seleção tetraciclina.
Posteriormente a essa etapa, a adaptação metabólica foi empregada, seguida de
planejamentos experimentais de superfície de resposta; os quais avaliaram a adição de
glicose e xilose no meio de cultivo em diferentes concentrações, bem como de hidrolisado
hemicelulósico em diferentes proporções. As condições ótimas para o processo SSF
utilizando-se a bactéria Zymomonas mobilis nativa, empregando o bagaço de cana pré-
tratado e o resíduo da indústria de celulose, respectivamente, foram: teor de sólido, 30% e
20%; carga enzimática, 25 FPU/g e 17,5 FPU/g; concentração celular, 4 g/L e 1,59% (v/v);
atingindo a concentração final de etanol de 60 g/L e 58 g/L; avaliando a adição dos
nutrientes complementares ao processo SSF: extrato de levedura, 12,5 e 6,25 g/L; KH
2
PO
4
,
2,5 e 1,25 g/L; (NH
4
)
2
SO
4
, 1,5 e 2,25 g/L e MgSO
4
, 1,5 e 2,25 g/L. Os melhores resultados
alcançados foram de 65 g/L e 54 g/L de etanol. Foi alcançado 25 g/L de etanol, constatando-
se que cerca de 50% desta pentose foi convertida ao produto, a partir do processo SSCF
pela linhagem Zymomonas mobilis CP4 recombinante, empregando 30% de sólidos, 20,5%
de hidrolisado hemicelulósico, 10 mg/L de tetraciclina, carga enzimática de 25 FPU/g de
celulignina e 10% (v/v) de inoculo inicial. Os resultados alcançados com o presente trabalho
foram satisfatórios e apontam para o desenvolvimento de novas pesquisas.
xi
ABSTRACT
SANTOS, Danielle da Silveira dos.
Second generation ethanol production by
native
and
recombinant
strain of
Zymomonas
mobilis employing
lignocellulosic biomass. Supervisor: Nei Pereira Jr. School of Chemistry of
Federal University of Rio de Janeiro
–
Brazil, 2012.
During the past decades, considerable efforts have been made to utilize agricultural and
forest residues as biomass feedstock for the production of bioethanol as an alternative fuel.
Sugarcane bagasse, composed of 38.1 w% cellulose, 28.4 w% hemicellulose and 18.4 w%
lignin, represents the main lignocellulosic material to be considered by most of tropical
countries. The bacterium Zymomonas mobilis possesses technological advantages which
make of it a potential fermentative agent for industrial ethanol production: fast glucose
uptake, high ethanol tolerance and production yields, besides the ability of fermenting in
anaerobiose. Compared with Saccharomyces cerevisiae, the ethanol yield and specific
productivity of Zymomonas mobilis are higher, because less biomass is produced and a
higher metabolic rate of glucose is maintained through its special Entner
–
Doudoroff
pathway. The bacterium Zymomonas mobilis was shown to be extremely attractive for the
ethanol second generation production from glucose of the cellulosic fraction, due to its high
capacity to absorb this sugar, resulting in high ethanol productivity values. However, the
wild-type strains proved to be unable to metabolize xylose arisen from the hemicellulose
fraction. In order to turn the strain used in this study also able to ferment xylose into ethanol
and make more efficient the production of second generation ethanol, the incorporation of
molecular biology techniques was planned. Thus, the aim of this study was to evaluate the
fermentation utilizing strains of Z. mobilis by simultaneous saccharification and fermentation
(SSF) and simultaneous saccharification for and co-fermentation (SSCF) processes, in
which the fermentation of both sugars occurs in one step. Initially, to make easier the
accessibility of cellulases to the cellulose microfibrils, the bagasse had to be submitted to a
pretreatment with diluted acid to fractionate it and extract the hemicellulose component
from the solid residue termed cellulignin. This solid residue was pretreated using NaOH
(4%) aiming at its partial delignification. Thereafter, the pretreated cellulignin underwent the
action of a commercial celulolytic preparation, allowing the conversion of cellulose to
glucose. This enzymatic pretreatment occurred under temperature of 50°C for 12 hours,
after which the temperature was reduced to 30°C and the system was inoculated with cells
of Z. mobilis. Regarding the genetic transformation, the Z. mobilis plasmid pZMO1 of 1565
kb was chemically synthesized and cloned into a synthetic vector, that contain the E. coli
and Z. mobilis replication checkmark origin; the XI, XK, TAL, TKL genes, and the
tetracycline resistance. Metabolic adaptation was performed, followed by response surface
experimental, evaluating the addition of glucose and xylose in the culture medium with
different concentrations, as well as hemicellulosic hydrolyzate in different proportions.
Employing the original strain, statistical experimental design was used to optimize the SSF
conditions, evaluating the solid content, enzymatic load and cell concentration by
submerged fermentation. Using the pretreated sugarcane bagasse and the paper industry
residue, respectively, the optimum conditions were found to be: solid content, 30% and
20%; enzyme load, 25 FPU/g and 17.5 FPU/g; cell concentration, 4 g/L and 1.59%(v/v),
resulting in a maximum ethanol concentration of 60 g/L and 58 g/L, evaluating the nutrients
addition in the SSF process: yeast extract, 12.5 and 6.25 g/L; KH
2
PO
4
, 2.5 and 1.25 g/L;
(NH
4
)
2
SO
4
, 1.5 and 2.25 g/L and MgSO
4
, 1.5 and 2.25 g/L, were achieved 65 g/L and 54
g/L of ethanol concentration. The recombinant Zymomonas mobilis CP4 strain reached 25
g/L of ethanol, confirming that about 50% of this pentose were consumed in the SSCF
process, employing 30% of solids, 20.5% of hydrolyzed hemicellulosic, 10 mg/L of
tetracycline, enzyme load of 25 FPU/g cellulignin, and 10% of the initial inoculum. The
results
were
very
interesting
and
pointed
out
for
future
developments.
xii
S
S
U
U
M
M
Á
Á
R
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I
I
O
O
CAPÍTULO 1
1
1. APRESENTAÇÃO DO TEMA
1
CAPÍTULO 2
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