2.6.7. MEIOS DE CULTIVO
Assim como grande parte dos organismos quimiorganotróficos, a
bactéria Z. mobilis necessita de fontes de nitrogênio, fósforo, enxofre e
micronutrientes para o funcionamento do metabolismo e para a síntese das
células em uma forma assimilável pelo microrganismo. Além disso, necessitam
de água, carbono, fator de crescimento e oxigênio. A glicose e o extrato de
levedura são fundamentais para a fermentação pelo microrganismo em estudo
(OTHUMOANGAT et al. 1999).
CAPÍTULO 2: Revisão Bibliográfica
Danielle da Silveira dos Santos
41
Nas fermentações com Zymomonas mobilis em meio de cultivo contendo
glicose, extrato de levedura, sulfato de amônio, fosfato de potássio e sulfato de
magnésio, quando a hexose é exaurida, cessa-se a utilização da fonte
inorgânica de nitrogênio NH
4
+
e a bactéria começa a metabolizar os
aminoácidos da meio como fonte de carbono, com liberação do nitrogênio na
forma de amônia, resultando em um aumento do pH do meio (ERNANDEZ et
al., 2009).
Alimentando-se novamente o meio com glicose após a sua exaustão, o
mecanismo gera um potencial eletroquímico e direciona o processo de
transporte de entrada deste carboidrato opera via excreção de prótons com os
produtos metabólicos por ação de uma proteína de membrana, a próton-
translocante ATPase, fazendo com que o pH do meio de cultivo decresça
gradualmente (ISHIZAKI et al., 1994).
Belaich et al. (1972) estudaram o efeito da limitação de pantotenato no
crescimento de Zymomonas mobilis, observando a redução da taxa específica
de crescimento. Sreekumar et al. (1999), citam que o mesmo é uma vitamina
essencial para a produção de etanol porque a bactéria não a sintetiza, embora
necessite desta substância para a produção de compostos orgânicos
essenciais ao crescimento celular, produzindo, consequentemente, o etanol.
Recentemente, Soleimani et al. (2012) também constataram que a
produção de etanol foi significativamente reduzida após remoção de nutrientes
do meio de cultura, tais como o extrato de levedura e peptona. No entanto,
alguns estudos demonstram que a utilização de alguns resíduos agro-
industriais pode substituir fontes de carbono ou nitrogênio, conforme observado
por Patle & Lal (2008).
2.6.7.1. Nitrogênio
A bactéria é capaz de utilizar diversas fontes de nitrogênio para o seu
crescimento, variando de simples componentes inorgânicos, como nitratos, a
componentes complexos, como os aminoácidos, mas nem todas as fontes de
nitrogênio suportam bem o crescimento bacteriano.
CAPÍTULO 2: Revisão Bibliográfica
Danielle da Silveira dos Santos
42
As rotas metabólicas para o metabolismo do nitrogênio podem ser
divididas em duas classes: a rota necessária para a assimilação do nitrogênio
proveniente do meio extracelular e a rota biossintética para a produção
intracelular de compostos que contêm nitrogênio. Os aminoácidos após a
metabolização são incorporados diretamente às proteínas ou catabolizados de
acordo com as necessidades da célula em termos de carbono, nitrogênio e
energia (ABUD, 2005).
A fonte de nitrogênio pode ser adicionada na forma de aminoácidos,
peptona, sais de amônia e peptídeos. Segundo França & Rodrigues (1985), os
sais de amônio e os aminoácidos conduzem para um melhor crescimento, uma
vez que não causam acúmulo de nitritos e nitratos. Sanchez & Demain (2002)
citam que, em geral, amônia, glutamina e asparagina são boas fontes de
nitrogênio, enquanto prolina, leucina e uréia são qualificadas como más fontes
de nitrogênio. Galani et al. (1985) constataram que sais como NH
4
Cl e
(NH
4
)
2
SO
4
são as melhores fontes de nitrogênio. Pinheiro (2001) ressaltou uma
relação mássica entre glicose e asparagina (entre 75:1 e 100:1), para a qual a
bactéria apresenta a maior taxa de crescimento.
Neto et al. (2005) notaram que grandes concentrações de extrato de
levedura podem provocar diminuição da produção de etanol, devido a um
excesso de fonte de nitrogênio. Desta forma, ocorre um aumento na
concentração de biomassa, uma vez que Zymomonas utiliza esse composto
não apenas como fonte de nitrogênio, mas também como blocos para
biossíntese, implicando em uma menor necessidade de energia. Tal fato
justificaria a diminuição na produção de etanol e, consequentemente, a menor
formação de ATP. A regulação do nitrogênio é de fundamental importância na
microbiologia industrial, uma vez que afeta a síntese de enzimas envolvidas
tanto no metabolismo primário quanto no secundário. Desta forma, muitas rotas
metabólicas secundárias são negativamente afetadas por fontes de nitrogênio
favoráveis ao crescimento, como os sais de amônio, assim como elevadas
concentrações de nitrogênio podem afetar a síntese dessas enzimas (BELAÏCH
& SENEZ, 1965; Neto et al., 2005).
CAPÍTULO 2: Revisão Bibliográfica
Danielle da Silveira dos Santos
43
2.6.7.2. Fósforo
O fósforo tem papel importante nas vias metabólicas que são iniciadas
com uma fosforilação do substrato. Esse elemento, constituinte das moléculas
de ATP, é absorvido pelas células sob a forma de sais, como KH
2
PO
4
ou
K
2
HPO
4
(RANZAN, 2010).
2.6.7.3. Enxofre
O enxofre, constituinte estrutural da célula é de grande importância para
a formação de proteínas, pode ser suprido por metionina, cisteína e sulfatos
(FRANÇA & RODRIGUES, 1985). No entanto, MgSO
4
é a melhor fonte deste
elemento, por servir também como de fonte de magnésio; que por sua vez é
responsável pela estabilidade estrutural de diversas enzimas, como também
por prevenir a formação de vesículas na membrana externa da célula (GALANI
et al., 1985).
2.6.8. Meios de cultivo de baixo custo
A elaboração de meios de cultivo de baixo custo é um importante fator
em processos fermentativos industriais. Desta forma, Neto et al. (2005)
reportaram a utilização de melaço de cana, subproduto da indústria do açúcar,
que apresenta alta concentração de sacarose. Através de um planejamento
experimental, onde as variáveis estudadas foram: a concentração de sacarose,
a concentração de extrato de levedura e o tempo, as condições ótimas para a
produção de etanol do melaço foram, respectivamente, 100 g/L, 2,0 g/L e 24
horas. Recentemente, Thanonkeo et al. (2011) também obtiveram sucesso ao
avaliar a produção de etanol a partir de alcachofra de Jerusalém pela linhagem
de Z. mobilis isolada na Tailândia, TISTR548, alcançando 95,9 g/L de etanol a
partir de 250 g/L de açúcares redutores totais.
Ruanglek et al. (2006) utilizaram meio sintético contendo glicose como
substrato (100 g/L), além de fontes de nitrogênio provenientes de resíduos
agro-industriais de Ajinomoto Co. Ltd. atingindo cerca de 43 g/L de etanol. O
mesmo resultado foi alcançado quando adicionou-se 10 g/L de extrato de
levedura.
CAPÍTULO 2: Revisão Bibliográfica
Danielle da Silveira dos Santos
44
A formulação de meios com diferentes composições foi reportada por
Tanaka et al. (1999), que utilizaram suco de abacaxi sem diluição, contendo
125 g/L de sacarose, e traços de glicose e frutose, além de outros
componentes em menores proporções, como Mg, Ca, P, Fe, Na e K. Foi
alcançada a concentração de 59 g/L de etanol, sem nenhum controle de pH e
agitação. Em seguida, os autores fizeram a comparação com a fermentação
em meio sintético nas mesmas concentrações de sacarose, além da adição de
extrato de levedura e de outros nutrientes, reduzindo-se a concentração de
etanol para 42,5 g/L, sob as mesmas condições de pH e agitação.
Silva et al. (2007) utilizaram a farinha de algaroba na formulação do
meio para a fermentação pela bactéria Z. mobilis, atingindo 77 g/L de etanol.
Através de um planejamento experimental, foi constatado que a condição ótima
da farinha era de 30% (m/v), a qual apresentou elevados níveis de nutrientes,
principalmente açúcares, e minerais, como o fósforo e o cálcio.
Patle & Lal (2008) investigaram a fermentação por Z. mobilis e C.
tropicalis em resíduos agro-industriais de amido, o thippi -subproduto do
processo do processamento de amido, contém além deste carboidrato, pectina,
fibras e proteínas- atingindo 72,8 g/L de etanol quando as duas culturas
microbianas ocorriam simultaneamente e 65,3 g/L apenas com a bactéria Z.
mobilis.
Soleiman et al. (2012) reportaram a otimização das melhores condições
fermentativas pela linhagem de Z. mobilis PTCC 1718 (DSMZ 424), utilizando
resíduos de baixo custo, tais como soro de leite e farelo de trigo, associados à
nutrientes sintéticos, onde as melhores condições foram de 25 g/L de sacarose,
15 g/L de soro de leite, 2,5 g/L de farelo de trigo, 5 g/L de extrato de levedura,
2,5 g/L de peptona, 7 g/L KH
2
PO
4
, 1 g/L de (NH
4
)
2
SO
4
, e 0,5 g/L MgSO
4
; sob
50
o
C de temperatura, pH 5,5 e inóculo de 12% (v/v); alcançando até 91,22 g/L
em biorreator instrumentado, durante 48 horas.
Dwidar et al. (2012) obtiveram 25 g/L de etanol por Z. mobilis ZM4 a partir
de 55-60 g/L de bebidas carbonatadas, em 10 horas de fermentação. Os
autores ressaltam a importância de tal pesquisa, indicando que estudos
CAPÍTULO 2: Revisão Bibliográfica
Danielle da Silveira dos Santos
45
posteriores apontam para a produção de etanol em maior escala a partir destes
resíduos industriais.
2.6.9. PRODUÇÃO DE ETANOL CONVENCIONAL POR Z. mobilis
A bactéria Z.mobilis possui um grande potencial para a produção
industrial de etanol a partir de açúcar, xarope e caldo de cana, dentre outros
substratos (LEE & HUANG, 2000). Comparações de resultados recentes
reportados na literatura utilizando a bactéria Zymomonas mobilis na
fermentação de etanol convencional estão apresentadas na tabela 2.4.
A produtividade e produção de etanol variam, dentre diversos fatores, de
acordo com o substrato empregado, nutrientes adicionais, bem como o
microrganismo a ser utilizado. Pinilla et al. (2011) obtiveram elevadas
concentrações de etanol (83,81 g/L), a partir de glicose adicionada de extrato
de levedura, peptona e sais, após isolamento de colônias crescidas no melaço
de cana. Já Wiikins (2009) empregaram misturas de açúcares, frutose, glicose,
sacarose e galactose, atingindo 43,5 g/L de etanol ao final do processo
fermentativo, ao passo que Maiti et al. (2011) alcançaram 58,4 g/L a partir de
melaço de cana-de açúcar.
Sabe-se que bactéria Z. mobilis possui baixa tolerância a sais quando
está na sua forma livre, entretanto, a imobilização proporciona maior aceitação
desses compostos, assim como reduz a produção de sorbitol pelo
microrganismo (IIDA et al., 1993). Tais autores estudaram a imobilização em
diversas linhagens de Z. mobilis (B-69 147, MX 3303, HSZA 1006, HSZI 4160,
e NRRL B-14023) utilizando gel de resina (photo-crosslinkable) através de um
processo contínuo, atingindo 80 g/L de etanol e 60 g/L.h de produtividade
volumétrica pela linhagem B-69 147, durante 14 dias. O desempenho da
linhagem utilizada foi superior ao do microrganismo Saccharomyces uvarum,
que a partir de 200 g/L de glicose inicial, produziu 60 g/L de etanol, bem como
cerca de 44 g/L.h de produtividade volumétrica.
CAPÍTULO 2: Revisão Bibliográfica
Danielle da Silveira dos Santos
46
Tabela 2.4. Principais resultados relatados na literatura para produção de etanol convencional por Zymomonas mobilis.
Onde: MP: matéria-prima; xil: xilose; gli: glicose; fru: frutose; sac: sacarose; gal: galactose; ART: açúcares redutores totais; FA:
frascos agitados; BR: biorreator; Q
P
: produtividade volumétrica em etanol.
Referências Bibliográficas: 1. SILVA (2007); 2. ZHANG (2003); 3.CAZETTA et al. (2007); 4. TANAKA et. al. (1999); 5. WIIKINS
(2009); 6. ZHANG et al. (2008); 7. NETO et al. (2005); 8. COSTA et al. (2001); 9.
MAITI et al. (2012); 10. RUANGLEK et al. (2006); 11.
DAVIS et al. (2006); 12. BANDARU et al. (2006); 13. PATLE & LAL (2008).
MP/Meio
Substrato
X
o
Sistema
reacional
Etanol
(g/L)
Q
P
(g/L.h)
Ref.
Farinha de algaroba
30% (m/v)
5% (v/v)
FA
77
4,3
1
Meio sintético
35 g/L de xil + 35 g/L de gli
2,5 g/L
BR
38
1,59
2
Meio sintético
200 g/L de sac
0,2 g/L
FA
55,8
1,16
3
Suco de abacaxi
125 g/L de sac
10 % (v/v)
BR
59
2,81
4
Meio sintético
29.9 g/L de fru; 7.7 g/L de gal;
51,7 g/L de gli; 1,3 g/L de sac
0,3 g/L
FA
43,5
0,60
5
Meio sintético
200 g/L de gli
1,8 g/ L
FA
72,5
1,2
6
Melaço de cana
100 g/L de ART
2 g/L
FA
30
1,25
7
Meio sintético
20% (v/v)
10% (v/v)
BR
67,7
2,25
8
Melaço de cana
216 g/L de ART
Não consta
BR
58,4
1,33
9
Meio sintético
100 g/L de gli
2,3 g/L
FA
43
2,38
10
Amido Hidrolisado
110 g/L de gli
10% (v/v)
BR
54
4,90
11
Sagu
150 g/L de amido
93,2 g /L de
esferas
FA
55,3
3,20
12
Resíduos alimentares
254.45 g. kg
-1
2.8x10
8
CFUmL
-1
FA/ BR
72,8
1,51
13
CAPÍTULO 2: Revisão Bibliográfica
Danielle da Silveira dos Santos
47
Amutha & Gunasekaran (2001) também empregaram a tecnologia de
imobilização associada à fermentação, atingindo 46,7 g/L de etanol a partir de
hidrolisado de mandioca por células co-imobilizadas de Z. mobilis e S.
diastaticus, contrastando com 37,5 g/L por S. diastaticus. Já Bandaru et al.
(2006) avaliaram a co-imobilização de células de Z. mobilis MTCC 92, assim
como da enzima amiloglicosidase, onde a produção de etanol ocorreu em
55,3 g/L, na temperatura de 32,4
o
C, pH 4,93, durante 17,24 horas, a partir de
150 g/L de amido.
Behera et al. (2010) compararam a performance de Z. mobilis
(MTCC92) e S. cerevisiae (CTCRI) frente à produção de bioetanol a partir das
flores de Madhuca latifólia L. Após 96 h de fermentação, a produção e
produtividade de etanol foi de 20,47 e 24,83 g/L; 0,213 e 0,258 g/L.h,
respectivamente. Bansal & Singh (2003) também reportaram que a levedura
produziu maiores concentrações de etanol do que a bactéria em meio de
fermentação contendo 15% (m/v) de açúcares; assim como os estudos
realizados por McGheeet al. (1981), apontando para o maior desempenho da
levedura imobilizada em processo contínuo, a partir de concentrações de 1%
a 5% de glicose. No entanto, Raman & Pothiraj (2008) afirmaram que a
bactéria apresenta melhor desempenho em relação à levedura, atingindo 9,25
g/L e 8,73 g/L de etanol, respectivamente, a partir de resíduos da mandioca,
em pH 6, durante 36 h.
2.6.9.1. Inibição pelo produto, substrato e temperatura
Karsch et al. (1983) propuseram que o microrganismo Z. mobilis
apresenta maior produção de etanol e menor crescimento de biomassa em
relação à levedura S. cerevisiae, tendo como uma de suas peculiares
características, a variação do pH de 5,5 a 3,8. No entanto, a levedura
apresenta maior aplicabilidade na produção industrial, por ser menos sensível
a alguns fatores, tais como temperatura elevada e toxicidade ao etanol,
podendo desencadear um estresse fisiológico na bactéria, o que pode alterar
a fluidez da membrana plasmática, provocando redução do crescimento
específico, prejudicando a viabilidade celular, bem como a habilidade
CAPÍTULO 2: Revisão Bibliográfica
Danielle da Silveira dos Santos
48
fermentativa (OSMAN et al., 1985; BARBOSA et al., 1994; MOREAU et al.,
1997; THANONKEO et al., 2007).
É importante ressaltar que há controvérsias em relação à faixa de
inibição pelo etanol e temperatura do processo, variando de acordo com a
linhagem e o substrato empregado, conforme experimentos realizados por
Ernandez et al. (2009) e Gunassekaran & Raj (1999). Utilizando 20% de
sacarose, Jobses et al. (1985) relataram que a concentração limitante deste
álcool foi de 57,5 g/L, provocando redução do crescimento celular, bem como
um aumento do substrato residual. Já a partir da glicose, a bactéria
apresentou tolerância nas concentrações de 70 a 80 g/L (GALLEGOS et al.
2006).
Panesar et al. (2007) constataram que a linhagem Zymomonas mobilis
MTCC2428 tolera até 8% (v/v) de etanol em meio contendo glicose, em
temperatura de 30°C. No entanto, quando a temperatura se elevou para 35 e
40°C, o microrganismo tolerou apenas 6 % (v/v) e 2 % (v/v) deste produto,
respectivamente.
Adicionalmente, Lee, Wroble e Ross (1989) notificaram que em
temperaturas próximas de 40°C, os rendimentos de formação de biomassa e
produção do álcool por tal microrganismo decresciam. Porém, as taxas
específicas de consumo de substrato, crescimento e formação de produtos
não foram afetadas.
Ranzan (2010), e Bekers et al.(1990) estudaram as oscilações que
ocorrem no processo fermentativo pela bactéria em questão, indicando que
estas são decorrente da inibição pelo produto ou pelo substrato, ambos em
elevadas concentrações. Consequentemente, as oscilações podem afetar a
produção de etanol e de biomassa, aumentando as concentrações de
açúcares residuais.
Estudos iniciais desenvolvidos por Rogers et al. (1979) aplicaram
elevadas concentrações de substrato, onde houve a conversão de 250 g/L de
glicose a 100 g/L de etanol no período de 40 horas, empregando Zymomonas
mobilis ATCC10988 e Saccharomyces carlsbergensis (uvarum). O
CAPÍTULO 2: Revisão Bibliográfica
Danielle da Silveira dos Santos
49
crescimento de biomassa bacteriana foi consideravelmente menor do que o
obtido pela levedura, indicando maior taxa específica de consumo deste
açúcar, assim como maior produção de etanol pelo microrganismo. Segundo
Torres (1987), concentrações superiores a 156,0 g/L de glicose provocam
inibição no crescimento da linhagem Z. mobilis (ZAP) na temperatura de
35°C. Na medida em que a temperatura se eleva, a mesma torna-se inibitória
para o crescimento.
Segundo Zhang et al. (2008), a presença de solutos compatíveis na
produção de etanol por Z. mobilis diminui relativamente a inibição pelo
substrato em altas concentrações. Os autores avaliaram a fermentação a
partir de 200 g/L de glicose, atingindo concentrações de etanol acima de 70
g/L; no entanto, a partir de 250 g/L deste açúcar, a produção decai para 66
g/L, devido à hiper osmolaridade causada pelas altas concentrações de
substrato no meio, associadas à presença de um soluto compatível, a ectoina,
composto natural que serve como uma substância protetora em algumas
células bacterianas.
Hermans (1992) avaliaram a fermentação contínua por Zymomonas
mobilis ATCC 29191 através da adição de diferentes concentrações de
glicose, 150,0; 170,0; 200,0 g/L, obtendo 4 g/L.h de produtividade volumétrica,
com rendimentos em etanol de 98% e taxa específica de 1,1 h
-1
. Costa et al.
(2001) também avaliaram a fermentação contínua de sacarose, 20% (m/v),
atingindo cerca de 65 g/L de etanol através da fermentação por Z. mobilis,
que apresentou oscilação em seu crescimento, devido às elevadas
concentrações desse açúcar.
Estudos pioneiros de Rogers et al. (1979) também constataram que
10% (v/v) de inoculo, crescido por até 25 horas, na temperatura de 30
o
C, era
o mais apropriado para a fermentação por Zymomonas mobilis, pois apesar
da produção de etanol ter aumentado juntamente com a adição de inóculo
acima desta proporção estabelecida, o tempo de processo não sofreu
alteração.
CAPÍTULO 2: Revisão Bibliográfica
Danielle da Silveira dos Santos
50
Adicionalmente, a produtividade volumétrica e a produção de etanol
podem ser afetadas pela presença de altos níveis de oxigênio, principalmente
em elevadas concentrações de substrato, assim como o dióxido de carbono
pode promover redução ou inibição do crescimento de biomassa, aumentando
a concentração de glicose residual do processo (BARATTI & BU´LOCK,
1986).
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