Tabela 5.9. Análise da variância da produção de etanol, empregando
diferentes concentrações de extrato de levedura, KH
2
PO
4
, (NH
4
)
2
SO
4
e
MgSO
4
.7H
2
O, através do processo SSF a partir de bagaço de cana pré-
tratado por Zymomonas mobilis CP4.
SQ
GL
MQ
Fisher
p>F
Modelo
3546,6
15
236,6
25,4
0,038
A
295,6
1
295,6
31,6
0,030
B
303,0
1
303,0
32,4
0,029
C
7,9
1
7,9
0,8
0,455
D
67,1
1
67,1
7,1
0,115
AB
13,9
1
12,91
1,3
0,360
AC
794,8
1
794,8
85,6
0,011
AD
449,1
1
449,1
48,1
0,020
BC
309,5
1
309,5
33,1
0,028
BD
383,8
1
383,9
41,1
0,023
CD
282,5
1
282,5
30,2
0,031
ABC
21,1
1
21,1
2,2
0,271
ABD
11,6
1
11,6
1,2
0,380
ACD
14,5
1
14,6
1,5
0,338
BCD
0,4
1
0,4
0,03
0,864
ABCD
595,7
1
595,7
63,8
0,015
Curvatura
1963,9
1
1963,9
210,4
0,004
Erro
18,7
2
9,3
Cor. Total
5532,1
18
SQ: Soma quadrática, GL: Grau de liberdade, MQ:Média quadrática, p>F: p-valor.
A: Extrato de levedura, B: KH
2
PO
4
, C: (NH
4
)
2
SO
4
, D: MgSO
4
.7H
2
O.
Os experimentos em frascos agitados foram reproduzidos em biorreator
sob condições controladas, nas seguintes condições operacionais: relação
sólido líquido de 3:10 (g:mL), carga enzimática de 25 FPU/g de celulignina e
CAPÍTULO 5: Resultados e Discussões
Danielle da Silveira dos Santos
133
concentração inicial de células de 4 g/L (SANTOS et al., 2010) (Figura 5.13).
Após a pré-hidrólise enzimática, a bactéria foi inoculada, dando início ao
processo SSF, atingindo 53 g/L de etanol e produtividade volumétrica de 2,20
g/L.h.
Figura 5.13. Perfil cinético do processo de hidrólise enzimática de celulose e
fermentação simultâneas a partir de bagaço de cana pré-tratado por Z. mobilis
CP4, nas melhores condições preconizadas pelo modelo: 2,5 g/L de extrato de
levedura, 1 g/L de KH
2
PO
4
, 0,5 g/L de (NH
4
)
2
SO
4
e 0,5 g/L de MgSO
4
.7H
2
O,
atingindo 53 g/L de etanol, em biorreator instrumentado. Condições
operacionais: relação sólido líquido de 3:10 (g:mL), carga enzimática de 25
FPU/g e concentração inicial de células de 4 g/L. P.H.= pré-hidrólise
enzimática, SSF: fermentação e sacarificação simultâneas.
Através deste estudo preliminar foi possível constatar que os nutrientes
analisados: KH
2
PO
4
(g/L), MgSO
4
.7H
2
O(g/L), (NH
4
)
2
SO
4
e extrato de levedura
(g/L) promoveram maiores concentrações de etanol quando estavam em seus
maiores níveis: 1 g/L, 0,5 g/L, 0,5 g/L e 2,5 g/L, respectivamente. No entanto,
houve a necessidade de ser feito um planejamento experimental completo
visando à otimização da produção de etanol, uma vez que a curvatura
apresentou-se significativa (p<0,05). Desta forma, foram adicionados pontos
axiais, promovendo os graus de liberdade necessários para a elaboração de
um modelo quadrático que permita maximizar a concentração de etanol.
SSF
P.H.
CAPÍTULO 5: Resultados e Discussões
Danielle da Silveira dos Santos
134
Planejamento Composto Central Rotacional
Conforme descrito anteriormente, um planejamento fatorial 2
4
foi
realizado; no entanto, foi recomendado empregar o método de Superfície de
Resposta, adequado para identificar o efeito de variáveis individuais, buscando
então por melhores condições para um sistema multivariável eficiente,
conforme demonstrado na tabela 5.10 (YU et al., 2009).
Tabela 5.10. Planejamento Composto Central 2
4
, avaliando efeitos da adição
de extrato de levedura (g/L), KH
2
PO
4
(g/L), (NH
4
)
2
SO
4
(g/L) e MgSO
4
.7H
2
O
(g/L) na produção de etanol através do processo SSF a partir de bagaço de
cana pré-tratado, na relação sólido:líquido 3:10 (g:mL) e carga enzimática de
25 FPU/ g, por Z. mobilis CP4.
Exp.
Variáveis
Resposta
E. L.
(g/L)
KH
2
PO
4
(g/L)
(NH
4
)
2
SO
4
(g/L)
MgS0
4
.7H
2
0
(g/L)
Etanol
(g/L)
1
6,25
1,25
0,75
0,75
54,2
2
18,75
1,25
0,75
0,75
62,6
3
6,25
3,75
0,75
0,75
45,7
4
18,75
3,75
0,75
0,75
59,3
5
6,25
1,25
2,25
0,75
38,1
6
18,75
1,25
2,25
0,75
60,3
7
6,25
3,75
2,25
0,75
34,8
8
18,75
3,75
2,25
0,75
52,4
9
6,25
1,25
0,75
2,25
32,9
10
18,75
1,25
0,75
2,25
57,8
11
6,25
3,75
0,75
2,25
33,2
12
18,75
3,75
0,75
2,25
56,4
13
6,25
1,25
2,25
2,25
28,5
14
18,75
1,25
2,25
2,25
54,7
15
6,25
3,75
2,25
2,25
48,1
16
18,75
3,75
2,25
2,25
63,0
17
0,0
2,5
1,5
1,5
30,4
18
25,0
2,5
1,5
1,5
65,4
19
12,5
0,0
1,5
1,5
33,6
20
12,5
5,0
1,5
1,5
38,2
21
12,5
2,5
0,0
1,5
34,9
22
12,5
2,5
3,0
1,5
37,3
23
12,5
2,5
1,5
0,0
34,1
24
12,5
2,5
1,5
3,0
62,7
25
12,5
2,5
1,5
1,5
65,2
26
12,5
2,5
1,5
1,5
63,4
27
12,5
2,5
1,5
1,5
62,6
28
12,5
2,5
1,5
1,5
61,3
29
12,5
2,5
1,5
1,5
62,8
30
12,5
2,5
1,5
1,5
60,0
Onde: E.L.: e
xtrato de levedura.
CAPÍTULO 5: Resultados e Discussões
Danielle da Silveira dos Santos
135
Os parâmetros analisados foram os mesmos do Planejamento Fatorial,
concentrações de extrato de levedura, KH
2
PO
4
, (NH
4
)
2
SO
4
e MgSO
4
.7H
2
O,
adicionados à celulignina pré-tratada no início da hidrólise, que junto com a
glicose gerada, permitiu a implementação do processo de sacarificação e
fermentação simultâneas. A maior concentração de etanol obtida foi de 65 g/L,
com 12,5 g/L de extrato de levedura, 2,25 g/L de KH
2
PO
4
, 1,5 g/L (NH
4
)
2
SO
4
e
1,5 g/L de MgSO
4
.7H
2
O. A presença de maiores concentrações de extrato de
levedura, rico em nitrogênio, aumentou significativamente a produção de
etanol, como indicado pela comparação dos experimentos 9 e 10. Estes
possuem as mesmas concentrações de nutrientes, entretanto, quando o extrato
de levedura foi acrescentado, a produção de etanol aumentou de 18 g/L a 40
g/L.
Nos experimentos de 17, 19, 21 e 23, os quais não foram adicionados de
extrato de levedura (g/L), KH
2
PO
4
(g/L), (NH
4
)
2
SO
4
(g/L) e MgSO
4
.7H
2
O (g/L), o
etanol foi produzido nas concentrações de 11, 37, 26 e 26 g/L,
respectivamente. Adicionalmente, comparando os resultados entre os
experimentos 1 e 15, nota-se que o efeito sinérgico entre os parâmetros
analisados faz-se necessário, uma vez que foram empregadas baixas
concentrações de todos os nutrientes adicionados, assim como elevadas
concentrações dos mesmos, com exceção de extrato de levedura, atingindo 38
g/L e 15 g/L de etanol, respectivamente.
A análise estatística de variância obtida pelo Planejamento Composto
Central Rotacional, indicado na tabela 5.11, mostra que o modelo foi muito
significativo, com p<0,05, apresentando elevado coeficiente de determinação
total (R
2
) observado para a resposta ao etanol, em 0,995. Além disso, o resíduo
foi baixo e não significativo (p>0,05), o que não invalidou o modelo para fins de
preditivos.
O modelo da concentração de etanol é apresentado na equação (5).
[Etanol]=+52.17+131,29A+3,05B+2,50C+6,59D1,00AB+0,38AC+2,00AD+1,50B
C+3,63BD+3,50CD+8,65A
2
-5,07B
2
-5,04C
2
-59D
2
-0,88ABC-1,25ABD-
1,88ACD+1,50BCD-2,43A
2
B-3,50A
2
C-8,96A
2
D-85,12AB
2
-36,42A
3
(5)
CAPÍTULO 5: Resultados e Discussões
Danielle da Silveira dos Santos
136
Tabela 5.11.
Análise de variância da produção de etanol, empregando diferentes
concentrações de extrato de levedura, KH
2
PO
4
, (NH
4
)
2
SO
4
e MgSO
4
.7H
2
O, através
do processo SSF a partir do bagaço de cana pré-tratado, na relação sólido:líquido
3:10 (g:mL) e carga enzimática de 25 FPU/ g, por Z. mobilis CP4.
SQ
GL
MQ
F-Valor
p > F
Modelo
4892,51
22
222,39
69,32
< 0,0001
A
481,44
1
481,44
150,06
< 0,0001
B
749,55
1
749,55
233,62
< 0,0001
C
72,52
1
72,52
22,60
0,0021
D
301,53
1
301,53
93,98
< 0,0001
AC
7,56
1
7,56
2,36
0,1686
AD
45,56
1
45,56
14,20
0,0070
BC
52,56
1
52,56
16,38
0,0049
BD
175,56
1
175,56
54,72
0,0001
CD
162,56
1
162,56
50,67
0,0002
A
2
360,80
1
360,80
112,46
< 0,0001
B
2
174,42
1
174,42
54,37
0,0002
C
2
1046,50
1
1046,50
326,18
< 0,0001
D
2
534.53
1
534.53
166.61
< 0.0001
ABC
22.56
1
22.56
7.03
0.0329
ABD
14.06
1
14.06
4.38
0.0746
ACD
39.06
1
39.06
12.18
0.0101
BCD
52.56
1
52.56
16.38
0.0049
A
2
B
749.31
1
749.31
233.55
< 0.0001
A
3
13.48
1
13,48
4,20
0,0795
B
3
726,28
1
726,28
226,37
< 0,0001
C
3
103,83
1
103,83
32,36
0,0007
D
3
567,00
1
567,00
176,73
< 0,0001
Resíduo
22,46
7
3,21
Lack of Fit
7,62
2
3,81
1,29
0,3545
Erro Puro
14,83
5
2,97
Cor Total
4914,97
29
SQ= Soma dos Quadrados, GL=Grau de Liberdade, MQ=Média Quadrática,
A: Extrato de levedura, B: KH
2
PO
4
, C: (NH
4
)
2
SO
4
, D: MgSO
4
.7H
2
O.
A variável B (KH
2
PO
4
) apresentou maior influência no modelo, seguida
da A (extrato de levedura), por sua vez a D (MgSO
4
.7H
2
O) e, finalmente, a C
([NH
4
]
2
SO
4
), que possui baixos valores de Soma dos Quadrados. A interação
das variáveis também resultou em altos valores de Fisher, o que aponta para
um elevado sinergismo entre os nutrientes na fermentação por Z. mobilis,
promovendo maior produção de etanol. A interação entre B e D (KH
2
PO
4
e
MgSO
4
.7H
2
O) mostrou-se a mais significativa estatisticamente, seguida da
interação entre C e D ([NH
4
]
2
SO
4
e MgSO
4
.7H
2
O) e entre B e C (KH
2
PO
4
e
[NH
4
]
2
SO
4
). As interações duplas entre os nutrientes analisados para a
CAPÍTULO 5: Resultados e Discussões
Danielle da Silveira dos Santos
137
produção de etanol indicam que a interação entre KH
2
PO
4
(g/L) e extrato de
levedura (g/L) é reduzida, sendo retirada do modelo. No entanto, o KH
2
PO
4
,
possui elevadas interações entre as variáveis representadas por (NH
4
)
2
SO
4
(g/L) e MgSO
4
.7H
2
O (g/L).
A Figura 5.14 mostra os gráficos de superfície de resposta,
apresentando a interação entre os parâmetros A, B, C e D, que representam o
extrato de levedura, o KH
2
PO
4
, o (NH
4
)
2
SO
4
, assim como
o MgSO
4
.7H
2
O,
respectivamente.
Figura 5.14. Superfície de resposta mostrando efeitos de MgSO
4
.7H
2
O (g/L) e
(NH
4
)
2
SO
4
(A),
KH
2
PO
4
(g/L) e MgSO
4
.7H
2
O (g/L) (B), KH
2
PO
4
(g/L) e (NH
4
)
2
SO
4
(C)e suas interações para a produção de etanol através do processo SSF por Z.
mobilis CP4 a partir do bagaço de cana pré-tratado, na relação sólido:líquido 3:10
(g:mL) e carga enzimática de 25 FPU/ g.
CAPÍTULO 5: Resultados e Discussões
Danielle da Silveira dos Santos
138
Na figuras 5.14 (A) (interação entre o MgSO
4
.7H
2
O e o (NH
4
)
2
SO
4
) e
5.14 (B) (interação entre o MgSO
4
e o KH
2
PO
4
), a produção de etanol
encontra-se em seu nível ótimo quando os mesmos encontram-se dos seus
níveis mínimos aos pontos centrais, mantendo os outros parâmetros nos níveis
médios. Já a figura 5.14 (C) mostra que a produção de etanol está em seu nível
ótimo quando as variáveis B e C, KH
2
PO
4
(g/L) e (NH
4
)
2
SO
4
, respectivamente,
estão nos seus pontos centrais.
Os resultados obtidos nos presentes experimentos são semelhantes aos
relatados por Yu et al. (2009), que otimizaram as concentrações de nutrientes
em meio sintético e notaram um efeito significativo do extrato de levedura sobre
a biomassa, quando o mesmo está associado à fonte de carbono. Os autores
observaram que o aumento da concentração de sulfato de amônio resulta em
um aumento na produção de etanol; entretanto, em níveis elevados podem
causar inibição. Assim como tais pesquisadores, nenhuma variação
significativa foi observada com a adição de fontes de fosfato e nitrogênio,
tornando o fosfato de potássio, bem como o sulfato de amônio estatisticamente
insignificantes. Provavelmente, o excesso de nitrogênio pode promover maior
produção de biomassa em relação à produção de etanol.
A reprodução das melhores condições estabelecidas pelo planejamento
experimental, relação de sólido:líquido de 3:10 (g:mL), carga enzimática de 25
FPU/g e concentração celular de 4 g/L, foi realizada em biorreator
instrumentado, atingindo 65 g/L de concentração de etanol, e produtividade
final de 2,70 g/L.h, a partir de 85 g/L de glicose inicial do processo, na
temperatura de 30ºC, agitação orbital de 150 rpm e pH 5 (Figura 5.15).
Os resultados obtidos mostraram que foi possível otimizar a produção de
etanol através da análise da adição de nutrientes no meio de fermentação,
após a execução de planejamentos experimentais sequenciais. Foi constatado
que o aumento da concentração de KH
2
PO
4
, o qual possui fósforo, utilizado
nas vias metabólicas do mecanismo energético das células, foi o principal
responsável pelo aumento da concentração de etanol, seguido do extrato de
levedura, MgSO
4
.7H
2
O e (NH
4
)
2
SO
4
. Dessa forma, as condições ótimas obtidas
CAPÍTULO 5: Resultados e Discussões
Danielle da Silveira dos Santos
139
para o processo SSF a partir do bagaço de cana foram as seguintes: extrato de
levedura (12,5 g/L), KH
2
PO
4
(2,5 g/L), (NH
4
)
2
SO
4
(1,5 g/L) e MgSO
4
(1,5 g/L),
resultando na concentração máxima de etanol em 65 g/L, com 85 g/L de
concentração inicial de glicose, atingindo a maior produtividade volumétrica de
2,63 g/L.h, na temperatura de 30ºC, agitação orbital de 150rpm e pH 5 em
biorreator instrumentado.
Figura 5.15. Perfil cinético da produção de etanol a partir de bagaço de cana
pré-tratado, na relação sólido:líquido 3:10 (g:mL) e carga enzimática de 25
FPU/ g, através do processo SSF por Z. mobilis CP4, utilizando 12,5 g/L de
extrato de levedura, 2,5 g/L de KH
2
PO
4
, 1,5 g/L de (NH
4
)
2
SO
4
e 1,5 g/L
MgSO
4
.7H
2
O no meio fermentativo. P.H.= pré-hidrólise enzimática, SSF:
fermentação e sacarificação simultâneas.
II.
Resíduo da indústria de celulose
O mesmo planejamento experimental utilizado anteriormente, para a
avaliação da adição de nutrientes adicionados na fermentação a partir do
bagaço de cana pré-tratado, foi empregado no processo SSF a partir de
resíduo da indústria de celulose, avaliando diferentes concentrações de
nutrientes adicionais, extrato de levedura, KH
2
PO
4
, (NH
4
)
2
SO
4
e MgSO
4
.7H
2
O
(Tabela 5.12).
P.H.
SSF
CAPÍTULO 5: Resultados e Discussões
Danielle da Silveira dos Santos
140
Tabela 5.12. Planejamento Superfície de Resposta 2
4
investigando efeitos da
adição de extrato de levedura, KH
2
PO
4
, (NH4)
2
SO
4
e MgSO
4
.7H
2
O na
produção de etanol a partir de resíduos da indústria de celulose, na relação
sólido:líquido 2:10 (g:mL) e carga enzimática de 17,5 FPU/ g, por Z. mobilis
CP4.
Ex.
Variáveis
Resposta
E. L.
(g/L)
KH
2
PO
4
(g/L)
(NH
4
)
2
SO
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