5.2. LINHAGEM RECOMBINANTE DE Zymomonas mobilis
Devido ao limitado espectro de açúcares fermentáveis pela bactéria Z.
mobilis nativa, buscamos pela construção de uma linhagem recombinante
deste microrganismo, através da incorporação de genes responsáveis pela
metabolização da xilose, açúcar mais abundante da fração hemicelulósica do
bagaço de cana-de-açúcar.
5.2.1. Etapa pós-transformação
Após a alteração genética do microrganismo Z. mobilis notou-se que o
mesmo apresentou crescimento em glicose (20 g/L) adicionada ao meio RM,
incluindo 10 mg/L de tetraciclina, conforme se observa na figura 5.18.
A
linhagem
naturalmente
ocorrente
apresentou
crescimento
praticamente nulo, diferentemente das linhagens geneticamente modificadas,
ORI e ORI ZYMO, que apresentaram crescimento de diversas colônias,
mostrando estarem devidamente transformadas para a resistência à
tetraciclina. Uma vez que o gene de resistência ao antibiótico está associado
ao gene de metabolização da xilose, a linhagem ORI ZYMO aparentemente
também seria modificada de forma simultânea, conforme observado nos
próximos experimentos.
Figura 5.18. Crescimento de diferentes linhagens de Z. mobilis após 168 h de
crescimento frente à utilização de meio RMG, contendo glicose (20 g/L),
KH
2
PO
4
(2 g/L), extrato de levedura (10 g/L), ágar (20 g/L) e tetraciclina (10
mg/L), na temperatura de 30
○
C. (A) Z. mobilis naturalmente ocorrente; (B) ORI:
bactéria cujo plasmídeo contém apenas o gene de resistência ao antibiótico;
(C) ORI ZYMO: bactéria cujo plasmídeo contém o gene de resistência ao
antibiótico, assim como o gene da metabolização de xilose.
CAPÍTULO 5: Resultados e Discussões
Danielle da Silveira dos Santos
150
5.2.2. Adaptação Metabólica em meio sintético
Yanase et al. (2007) já haviam afirmado sobre a necessidade de
aclimatações sucessivas na espécie recombinante Zymobarcter palmae no que
se refere a maiores rendimentos em etanol. Após tal procedimento, os autores
obtiveram aumento de 91% a 95% na eficiência da produção de etanol, bem
como redução de 5 a 8 horas de processo, quando as células eram crescidas
em xilose. Contudo, utilizando misturas de glicose e xilose, os resultados não
apresentaram alterações significativas. Visando otimizar a metabolização desta
pentose, buscando pela redução da produção de xilitol, Zhang et al. (2002) e
Viitanem et al. (2008) constataram que as linhagens de Zymomonas mobilis,
transformadas geneticamente, necessitam de um processo de adaptação para
posterior conversão da pentose.
A produção de 90 g/L de etanol, alcançada por Agrawal et al. (2011) foi
obtida após a aplicação do processo de adaptação metabólica, durante 80 dias,
através de 30 ciclos de aclimatações. As primeiras colônias foram crescidas no
meio RMGX e, posteriormente, os autores realizaram um aumento gradual da
concentração da pentose. Posteriormente, as culturas selecionadas
apresentaram maiores valores de atividade da enzima xilose isomerase, a qual
promoveu maior conversão a etanol e menor produção de xilitol pela pentose;
todavia, a atividade de XI ainda se apresentou baixa quando comparada às
outras três enzimas, XK, TAL, TKL. Adicionalmente, as colônias adaptadas e
as originais foram sequenciadas, porém nenhuma diferença genética pôde ser
comprovada. Os autores relataram sobre uma possível mutação envolvendo a
transcrição de XI das duas culturas. No entanto, tal fato não foi confirmado
através da técnica de SDS-PAGE, devido aos baixos níveis enzimáticos.
Dessa forma, os primeiros ciclos adaptativos desenvolvidos no presente
trabalho continham glicose em altas concentrações e baixas concentrações de
xilose; na medida em que os repiques eram realizados, as concentrações de
glicose eram reduzidas e as de xilose eram elevadas (Tabela 5.16). Conforme
relatado anteriormente, imediatamente após a transformação genética, o
microrganismo apresentava crescimento lento, em cerca de 170 horas, quando
comparado com os resultados desenvolvidos pela linhagem nativa, que cresciam
CAPÍTULO 5: Resultados e Discussões
Danielle da Silveira dos Santos
151
e fermentavam em até 48 horas. Após o 20
o
ciclo de repiques, o tempo de
crescimento bacteriano reduziu para cerca de 72 horas, aumentando lentamente
o consumo de xilose e acelerando o crescimento celular.
Tabela 5.16. Processo de adaptação metabólica mediante 50 ciclos, variando
as concentrações de glicose e xilose em meio sintético.
Ciclos
Tempo
(Dias)
Glicose inicial
(g/L)
Xilose inicial
(g/L)
Etanol*
(g/L)
Biomassa*
(g/L)
1-10
70
15
5
2,3
0,05
11-19
30
10
10
4,1
0,08
20-25
20
7,5
13,5
3,9
0,100
26-30
15
5
15
4,6
0,166
31-40
15
2,5
17,5
4,1
0,159
41-50
10
1,5
18,5
4,2
0,158
*Ao final do último ciclo.
A fase exponencial celular se estendeu após o 25
o
ciclo, atingindo 0,17 g/L
em cerca de 70 horas, nas concentrações de 15 g/L de xilose e 5 g/L de glicose,
adicionados do meio RM líquido. Por outro lado, as culturas dos primeiros ciclos
adaptativos atingiram valores de 0,05 g/L de células, durante 96 horas, nas
mesmas condições de processo, adicionadas de 15 g/L de glicose e 5 g/L de
xilose, concentrações favoráveis ao crescimento. Portanto, apesar de serem
necessárias melhorias na fermentação por Zymomonas mobilis geneticamente
modificada, o tempo de fermentação, assim como a tolerância à pentose foram
alterados.
Adicionalmente, a tabela 5.17 compara as variáveis de resposta deste
processo, avaliando diferentes etapas da adaptação metabólica em meio
sintético. Através destes cálculos foi confirmado que essa técnica tende a
promover melhores resultados de crescimento bacteriano, produção de etanol e
produtividade volumétrica, indicando que as colônias adaptadas (ciclo 40 a 50)
obtiveram em torno de duas vezes os valores alcançado nos primeiros ciclos (1
ao 10), em 0,05 g/L e 0,158 g/L de crescimento bacteriano; 2,3 g/L e 4,2 g/L de
produção de etanol; assim como 0,02 g/L.h e 0,04 g/L.h de produtividade
volumétrica para as colônias dos ciclos 1 a 10 e dos ciclos 40 a 50,
respectivamente.
CAPÍTULO 5: Resultados e Discussões
Danielle da Silveira dos Santos
152
Tabela 5.17. Comparação das variáveis de resposta entre diferentes etapas de
adaptação metabólica.
Variáveis medidas e calculadas
Ciclo 1-10 Ciclo 40- 50
Etanol (g/L)*
2,3
4,2
Células (g/L)*
0,05
0,158
Produtividade (g/L.h)*
0,02
0,04
*Ao final do último ciclo
A figura 5.19 sumariza o processo de adaptação metabólica em meio
sintético, indicando que as colônias de Z. mobilis recombinante aumentaram os
níveis de produção de etanol nos ciclos iniciais (1-30), porém mantiveram tais
níveis nos ciclos posteriores (31-50). Entretanto, cabe ressaltar que a técnica
aplicada nesta linhagem necessita de adaptações posteriores, no intuito de
reduzir integralmente as concentrações de glicose e aumentar a de xilose,
reduzindo o tempo de crescimento e de fermentação do microrganismo em
questão.
Figura 5.19. Histograma representando os 50 ciclos de adaptação metabólica,
empregando a linhagem recombinante de Z. mobilis em meio sintético.
CAPÍTULO 5: Resultados e Discussões
Danielle da Silveira dos Santos
153
5.2.3. Ensaios preliminares avaliando o consumo de glicose e xilose em
meio sintético por Z. mobilis geneticamente modificada
I. Planejamento Experimental
O intuito desta série experimental foi promover maior crescimento de
biomassa, portanto, os experimentos foram desenvolvidos em cultivo
estacionário (sem agitação), assim como em baixas concentrações de
substrato. Dessa forma, foi desenvolvido um planejamento experimental de
superfície de resposta avaliando a produção de etanol e o crescimento de
biomassa frente ao consumo de glicose e xilose em diferentes concentrações.
Os ensaios foram realizados após a execução de 10 ciclos de adaptação
metabólica e os resultados estão apresentados na tabela 5.18. Adicionalmente,
a tabela 5.19 indica outras condições empregadas de concentrações destes
açúcares, baseados nos estudos de Agrawal et al. (2011).
Aparentemente, nota-se que tal microrganismo utiliza os açúcares, em
sua maior proporção para o crescimento celular, atingindo 0,180 g/L. A maior
produção de etanol (7,5 g/L) ocorreu no experimento 13, a partir de 20 g/L de
glicose, 20 g/L de xilose, 2 g/L de KH
2
PO
4
, 10 g/L de extrato de levedura, e 10
mg/L de tetraciclina, no período de 72 horas. Cabe ressaltar que todos os
experimentos apresentaram consumo de xilose e glicose, assim como
produção de etanol e crescimento de biomassa; exceto o experimento 7
(Tabelas 5.18 e 5.19), cujo substrato era apenas a xilose e os nutrientes
complementares do meio RM. A dificuldade de crescimento exclusivamente em
xilose foi também relatada por Agrawal et al. (2011), sendo relacionada ao
deficiente transporte deste açúcar por Z. mobilis, dentre outras justificativas
relatadas na Revisão Bibliográfica.
Observa-se em todos os experimentos desenvolvidos, exceto no
experimento 3 da tabela 5.19, a presença de elevadas concentrações de xilose
residual, variando de 70 a 60% em relação à concentração inicial. Jeon et al.
(2002), Yanase et al. (2007), Zhang & Lynd (2010), Davis et al. (2005) e
Joachimsthal et al. (1999) também reportaram a presença de xilose residual no
processo de conversão de pentoses a etanol, em 21 g/L, 20 g/L, 2,5 g/L, 2,6
CAPÍTULO 5: Resultados e Discussões
Danielle da Silveira dos Santos
154
g/L,12 g/L, respectivamente. Adicionalmente, Lawford & Rousseau (2002)
reportam que apenas 50% da xilose foi consumida em meio com concentração
inicial de 30 g/L desta pentose (DIEN & COTTA, 2003).
Neste contexto, os experimentos empregando glicose e xilose em
concentrações variando de 0 a 20 g/L de cada açúcar pela linhagem
recombinante, comparativamente aos experimentos empregando apenas a
fração da glicose pela linhagem naturalmente ocorrente CP4 (item 5.1.1),
constatando-se diferenças significativas no crescimento celular e na
produtividade volumétrica de etanol, respectivamente, em 0,43 g/L e 0,33 g/L.h
para a linhagem nativa, assim como 0,180 g/L e 0,107 g/L.h para a linhagem
recombinante. Leksawasdi et al. (2001) já haviam reportado que a limitação
pelo substrato para o crescimento de biomassa é cerca de 3 vezes maior para
o consumo de xilose do que para a glicose.
Tabela 5.18. Planejamento experimental preliminar avaliando diferentes
concentrações de glicose e xilose no meio RM frente à produção de etanol e
crescimento de biomassa a partir de meio sintético pela linhagem recombinante
de Zymomonas mobilis CP4, realizado após a execução de 10 ciclos de
adaptação metabólica.
Ex.
Glicose (g/L)
Xilose (g/L)
Respostas
Inicial Final Inicial
Final
Etanol
(g/L)
Biomassa
(g/L)
1
10,5
0,0
10,5
6,0
5,0
0,080
2
1,3
0,0
10,5
6,2
1,9
0,046
3
10,5
0,0
10,5
5,8
4,3
0,112
4
10,5
0,0
10,5
6,7
3,4
0,116
5
4,0
0,0
4,0
2,5
2,7
0,065
6
17,0
0,0
17,0
11,3
6,9
0,165
7
4,0
0,0
17,0
10,8
2,5
0,073
8
10,5
0,0
19,7
13,2
3,6
0,062
9
10,5
0,0
10,5
6,9
4,9
0,123
10
17,0
0,0
4,0
2,7
6,8
0,166
11
10,5
0,0
1,3
1,0
5,4
0,127
12
10,5
0,0
10,5
9,2
3,8
0,102
13
19,7
0,0
10,5
7,5
8,6
0,090
CAPÍTULO 5: Resultados e Discussões
Danielle da Silveira dos Santos
155
Tabela 5.19. Avaliação de diferentes concentrações de glicose e xilose na
produção de etanol a partir de meio sintético pela linhagem recombinante de
Zymomonas mobilis CP4, após a execução de 10 ciclos de adaptação
metabólica.
Ex.
Glicose (g/L)
Xilose (g/L)
Respostas
Inicial Final
Inicial
Final
Etanol
(g/L)
Biomassa
(g/L)
1
1,0
0,0
20,0
13,5
1,7
0,044
2
2,5
0,0
20,0
13,5
2,3
0,064
3
5,0
0,0
20,0
0,1
2,1
0,096
4
10,0
0,0
20,0
13,7
4,6
0,133
5
15,0
0,0
20,0
12,6
3,4
0,155
6
20,0
0,0
20,0
11,6
7,5
0,180
7
0,0
0,0
20,6
20,6
0,0
0,044
O baixo rendimento em etanol a partir de misturas de glicose e xilose,
conforme descrito na Revisão Bibliográfica, pode ser justificado pela posterior
metabolização da pentose frente à hexose, gerando maiores concentrações de
inibidores nesta etapa, como o etanol e ácido lático, reduzindo a taxa de
utilização da pentose (LEKSAWASDI et al., 2001). Outra justificativa está
relacionada à competição pela única via de transporte de açúcares, causando
lentidão do processo, havendo uma repressão do consumo de xilose pela
glicose (DiMARCO & ROMANO, 1985; PARKER et al., 1995; ROGERS &
LAWFORD, 1999; LAWFORD et al., 2000; LEKSAWASDI et al., 2001;
MOHAGHEGHI et al., 2002; KIM et al., 2010).
De acordo com a análise de variância (Tabela 5.20) nota-se que o
modelo linear foi significativo, apresentando um ajuste adequado aos
resultados experimentais para este tipo de planejamento, com um coeficiente
de correlação R
2
de 0,9069; um baixo erro puro (média quadrática de 0,48) e,
uma falta de ajuste (média quadrática de 0,39) sem significância para o
intervalo de confiança de 90% (p-level
0,1).
A equação referente à concentração de etanol é apresentada na
equação (7).
[Etanol] =+1,32556 +0,36200A-0,050877B
(7)
CAPÍTULO 5: Resultados e Discussões
Danielle da Silveira dos Santos
156
Tabela 5.20. Análise de Variância da concentração de etanol a partir de
diferentes concentrações de glicose e xilose pela linhagem recombinante de Z.
mobilis CP4, após a execução de 10 ciclos de adaptação metabólica.
SQ
GL
MQ
F-Valor
p-valor
Modelo
41,26
2
20,63
48,70
<0,0001
A
40,39
1
40,39
95,33
<0,0001
B
0,87
1
0,87
2,07
0,1812
Resíduo
4,24
10
0,42
Lack of Fit
2,33
6
0,39
0,81
0,6093
Erro Puro
1,91
4
0,48
Cor. Total
45,50
12
Onde: A=glicose; B=xilose; SQ= soma dos quadrados; GL= grau de
liberdade; MQ= média quadrática.
A glicose apresentou maior efeito do que outra variável independente, a
xilose, sendo pouco significativa para o modelo. Adicionalmente, a figura 5.20
mostra a superfície de contorno, que representa as equações ajustadas para
concentração final de etanol a partir de xilose e glicose. Pode-se observar que
maiores concentrações de glicose, assim como menores concentrações de
xilose contribuem para o aumento da produção de etanol.
Figura 5.20. Superfície de contorno avaliando efeitos combinados entre a
glicose e a xilose sobre a produção de etanol por Z. mobilis recombinante,
após a execução de 10 ciclos de adaptação metabólica.
CAPÍTULO 5: Resultados e Discussões
Danielle da Silveira dos Santos
157
II. Comparação do desempenho de diferentes clones
Após o 20
o
ciclo de adaptação foram realizados ensaios em frascos
agitados, a 150 rpm e temperatura de 30
○
C, nas melhores condições do
planejamento anterior: 20 g/L de glicose, 20 g/L de xilose, adicionados do meio
RM, conforme observa-se na tabela 5.21.
Tabela 5.21. Avaliações de diferentes clones frente ao consumo de glicose e
xilose provenientes no meio RMGX, assim como à produção de etanol por
Zymomonas mobilis recombinante, após o 20
o
ciclo de adaptação metabólica.
A figura 5.21 representa a cinética de crescimento das colônias,
consumo de substratos e produto obtido, indicando que a pentose foi
metabolizada em cerca de 72 horas.
Nota-se que os clones se comportaram de forma semelhante,
apresentando cerca de 35% de consumo de xilose, consumo completo de
glicose, média de 0,16 g/L
de crescimento de biomassa e cerca de 4 g/L de
etanol. Os gráficos observados apontam para a grande necessidade de
contínuas adaptações metabólicas visando à obtenção de resultados mais
promissores, assim como relatado por Jeon et al. (2002), indicando que o
crescimento inicial das colônias ocorria em até 5 dias, sendo reduzido após
repiques sucessivos. Adicionalmente, o etanol pode estar sendo consumido
para a manutenção das células, após a saturação do consumo da glicose.
Apesar de Kim et al. (2010) terem reportado que apenas 10% da xilose
foi consumida na presença de glicose em concentração equimolar, os melhores
resultados obtidos neste trabalho foram alcançados nestas condições,
semelhante ao relatado por Zhang et al. (1995), que utilizaram 2,5% (m/v) dos
dois carboidratos.
Glicose (g/L)
Xilose (g/L)
Respostas
Inicial
Final
Inicial
Final
Etanol (g/L)
Biomassa (g/L)
20,0
0,0
20,0
12,99
3,25
0,158
20,0
0,0
20,0
13,25
4,80
0,136
20,0
0,0
20,0
13,33
3,66
0,193
20,0
0,0
20,0
13,70
4,93
0,153
CAPÍTULO 5: Resultados e Discussões
Danielle da Silveira dos Santos
158
Figura 5.21. Cinética comparativa de diferentes clones de Z. mobilis recombinante,
selecionados após crescimento em meio RMGX durante 72 horas, em 30
○
C de
temperatura e agitação de 150 rpm, após o 20
o
ciclo de adaptação metabólica.
5.2.4. Produção de etanol através do processo SSCF por Zymomonas
mobilis recombinante
I. Adaptação metabólica em meio SSCF
Conforme sinalizado na Revisão Bibliográfica, Zaldivar et al. (1999) e
Song et al. (2005) relataram que a presença de compostos inibitórios presentes
no hidrolisado hemicelulósico, em concentrações elevadas, provocam
modificações
morfológicas
nas
células
de
Z. mobilis,
tornando-se
arredondadas, cilíndricas e translúcidas. Delgenes et al. (1996) indicaram que
na presença de 2 g/L de furfural, o crescimento e a produção de etanol por tal
microrganismo foi inibido em até 64 e 44%, respectivamente. Lawford &
Rousseau (2002) apontaram para a inibição através da adição de 2,5 g/L de
ácido acético, em pH 5,5, reportando também que apenas 50% da xilose foi
consumida, a qual possuía a concentração de 30 g/L (DIEN et al., 2003).
CAPÍTULO 5: Resultados e Discussões
Danielle da Silveira dos Santos
159
Desta forma, estudos desenvolvidos por Lawford et al. (2002) sugerem
uma adaptação gradual ao ácido acético por Z. mobilis, assim como descrito
por Song et al. (2005), indicando que após longo período de crescimento na
presença destes compostos, as células adaptadas apresentam modificações
em sua superfície, tornando-se mais alongadas, dentre outras características.
Tais alterações morfológicas não foram detectadas no presente trabalho, no
entanto, ao longo de alguns ciclos adaptativos notou-se que a linhagem
transformada de Z. mobilis apresentou melhor performance quanto à produção
de etanol e crescimento celular frente ao hidrolisado ácido (Tabela 5.22).
Nos ciclos de 1 a 5, o microrganismo apresentava baixa produção de
biomassa (0,086 g/L), assim como lentidão de crescimento, uma vez que foi
utilizado o meio complementar RM, contendo 20 g/L de glicose, adicionado de
2,5% v/v de hidrolisado hemicelulósico. Quando comparado aos resultados das
colônias adaptadas (ciclo 21-25), a concentração de células foi ligeiramente
superior, em 0,117 g/L, no entanto, o hidrolisado hemicelulósico apresentava-
se em uma maior concentração no último ciclo, em 20% v/v.
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