Figura 5.4. Desempenho de Z. mobilis AG11 (A) e CP4 (B) em xilose.
g
lic
o
s
e
-
1
1
,7
0
5
1
2
,7
1
2
e
ta
n
o
l
-
1
5
,9
0
7
1
8
,9
6
2
2
3
,7
1
5
3
6
,9
4
6
3
7
,0
6
7
3
7
,1
5
0
mV
15,00
20,00
25,00
30,00
35,00
40,00
Minutes
0,00
2,00
4,00
6,00
8,00
10,00
12,00
14,00
16,00
18,00
20,00
22,00
24,00
26,00
28,00
30,00
32,00
34,00
36,00
38,00
40,00
CAPÍTULO 5: Resultados e Discussões
Danielle da Silveira dos Santos
114
Como colocado anteriormente, este ensaio se mostrou de suma
importância, pois permitiu definir a estratégia para a produção de etanol de
segunda geração; levando-se, inicialmente, a optar pelo aproveitamento
apenas da fração celulósica pelas linhagens nativas, através da concepção de
hidrólise enzimática simultânea à fermentação alcoólica.
5.1.2. Otimização do processo de hidrólise enzimática simultânea à
fermentação alcoólica por Zymomonas mobilis CP4
I.
Bagaço de cana-de-açúcar pré-tratado
Visando-se definir uma condição que resultasse em elevadas
concentrações de etanol a partir do processo SSF, um planejamento
experimental 2
3
, empregando o método de superfície de resposta, foi realizado.
A matriz experimental está apresentada na tabela 5.2, a qual contém os valores
das condições empregadas, avaliando a concentração de células, carga
enzimática e relação sólido:líquido do bagaço pré-tratado (g:mL); assim como
as respectivas respostas (concentração de etanol e produtividade volumétrica).
Os ensaios foram conduzidos de acordo com a metodologia descrita na
seção 4.3.3.2, empregando-se o processo de hidrólise enzimática da celulose
simultânea à fermentação, com um tempo de pré-hidrólise enzimática de 12 h.
Na figura 5.5 A, observa-se a celulignina de bagaço de cana-de-açúcar pré-
tratada e submetida a lavagens com água destilada e secagem, sem a adição
de meio e de enzimas, que se apresenta em estado sólido.
Na sequência, adicionou-se meio de cultivo, descrito no item 4.3.2, com
exceção da glicose, carga enzimática de 25 FPU/g, como preconizado por
Vásquez (2007
),
e relação sólido:líquido de 3:10 (g:mL) (Fig. 5.5. B). Após o
pré-tratamento enzimático o material sólido hidrolisado foi liquefeito, atingindo
cerca de 80 g/L de glicose, tornando-o próprio para a fermentação (Fig. 5.5. C).
Observa-se que as maiores concentrações de etanol foram obtidas para as
mais elevadas relações sólido:líquido, a exceção do experimento 4, no qual se
utilizou a carga enzimática em seu valor mínimo. Conforme reportado por
Vásquez (2007), a relação sólido: líquido e a carga enzimática são fatores
essenciais para a otimização do processo SSF, uma vez que o aumento no
CAPÍTULO 5: Resultados e Discussões
Danielle da Silveira dos Santos
115
teor de sólidos associado ao aumento da carga enzimática resultou em um
aumento nas concentrações de etanol.
Tabela 5.2. Planejamento Experimental de Superfície de Resposta 2
3
,
avaliando a relação sólido:líquido, carga enzimática e concentração celular
frente à produção de etanol a partir do bagaço de cana pré-tratado através do
processo SSF por Z. mobilis CP4.
Ex.
Condições
Respostas
S:L
(g:L)
CE
(FPU/g)
X
o
(g/L)
Glicose
(g.L
-1
)
Etanol
(g.L
-1
)
Q
P
(g/L.h)
1
0,32:10
17,5
2,5
12,3
6,5
0,23
2
2:10
17,5
5,02
70,7
35,2
1,49
3
2:10
17,5
2,5
69,9
33,8
1,42
4
3:10
10,0
4,0
33,8
13,7
0,5
5
2:10
17,5
2,5
69,9
33,8
1,45
6
3:10
10,0
1,0
35,5
14,9
0,5
7
1:10
10,0
1,0
17,2
5,9
0,2
8
3:10
25,0
4,0
80,3
60,7
1,52
9
2:10
17,5
2,5
70,5
30,6
1,38
10
2:10
17,5
2,5
69,5
33,4
1,42
11
1:10
10,0
4,0
20,1
13,4
0,41
12
1:10
25,0
1,0
26,3
14,7
0,85
13
1:10
25,0
4,0
33,8
17,9
0,88
14
2:10
30,11
2,5
76,6
36,8
0,94
15
3:10
25,0
1,0
80,7
48,7
0,98
16
2:10
17,5
0,02
50,5
6,9
0,06
17
3,68:10
17,5
2,5
10,6
6,2
0,42
18
2:10
17,5
2,5
70,6
29,1
1,41
19
2:10
4,89
2,5
12,8
5,4
0,21
20
2:10
17,5
2,5
70,6
34,9
1,39
Onde: S:L: relação sólido:líquido, CE: carga enzimática, Q
P=
produtividade
volumétrica, X
0
=concentração celular.
Figura 5.5. Material celulósico deslignificado (A), logo após a adição de
enzimas e meio (B) e após a pré-hidrólise enzimática (C).
CAPÍTULO 5: Resultados e Discussões
Danielle da Silveira dos Santos
116
A significância estatística das equações do respectivo modelo foi
verificada utilizando-se o teste de Fisher da análise de variância (ANOVA). No
tocante à concentração inicial de glicose, o modelo quadrático reduzido foi o
melhor modelo ajustado para o processo (após pré-hidrólise enzimática), pois
apresentou o maior valor de R
2
(0,8884).
Na tabela 5.3, observa-se que o Lack of Fit é apresentado como
significativo (p<0,05), embora o modelo tenha permanecido significativo (p-
valor inferior a 0,0001), não sendo invalidado. O Parâmetro C (concentração
celular) e suas interações foram removidos do modelo, uma vez que não
apresentam influência na liberação de glicose, pois esta é produzida durante a
pré-hidrólise enzimática, ou seja, antes da inoculação da bactéria. Por este
motivo, provavelmente, o Lack of Fit mostrou-se significativo. O parâmetro B
(carga enzimática) foi o mais influente na liberação de glicose, pois apresentou
os maiores valores de soma dos quadrados e de média quadrática, seguido do
parâmetro A (relação sólido:líquido) e logo, da interação AB.
Tabela 5.3. Análise de variância da concentração de glicose inicial do processo
SSF a partir do bagaço de cana pré-tratado por Z. mobilis CP4, através do
Planejamento Experimental de Superfície de Resposta 2
3
, avaliando a relação
sólido:líquido, carga enzimática e concentração celular.
SQ GL MQ F p >F
Modelo 1694,875 5
2338,97
22,29
< 0,0001
A
1313,64
1
1313,64
12,52
0,0033
B
3460,54
1
3460,54
32,98
< 0,0001
A
2
5681,33
1
5681,33
54,15
< 0,0001
B
2
944,23
1
944,23
9,00
0,0096
AB
662,48
1
662,48
6,31
0,0248
Resíduo
1468,91
14
104,92
Lack of Fit 1467,84
9
163,09
759,75
< 0,0001
Erro
1,07
5
0,21
Cor Total 13163,78
19
[Glicose]: [R
2
= 0,8884, R
2
Aj = 0,8486]
Onde, SQ= Soma Quadrática, GL= Grau de Liberdade, MQ= Média
Quadrática, F= Fisher Calculado, p >F= Probabilidade de Fisher.
A= relação sólido:líquido, B= carga enzimática, C= concentração celular.
O modelo de glicose resultante após a pré-hidrólise enzimática é
representado pela seguinte equação (1):
CAPÍTULO 5: Resultados e Discussões
Danielle da Silveira dos Santos
117
[Glicose] = -69.28050+67.60248 A+4.70742 B+1.21333 AB-19.75705 A
2
-
0.14319B
2
(1)
Os gráficos 3-D de superfície de resposta representam as equações de
regressão, mostrando a interação entre relação sólido:líquido, carga enzimática
e concentração celular para a concentração final etanol, produtividade
volumétrica e concentração inicial de glicose do processo SSF. Na figura 5.6,
observa-se o contorno de superfície resposta para a otimização da
concentração inicial de glicose do SSF. Os efeitos da relação sólido:líquido (A)
e carga enzimática (B) indicam que a concentração de glicose do SSF é maior
nos maiores níveis de carga enzimática e na maior relação sólido:líquido,
obviamente, pois quanto maior for o conteúdo sólido e maior for a carga
enzimática, maiores concentrações de açúcares serão liberadas no processo.
Figura 5.6. Superfície de resposta mostrando os efeitos combinados da
relação sólido:líquido (parâmetro A) e carga enzimática (parâmetro B) sobre a
concentração inicial de glicose do processo SSF a partir do bagaço de cana
pré-tratado.
No que concerne à concentração de etanol, o modelo utilizado para a
avaliação foi o Cúbico Reduzido, uma vez que apresentou maior valor para R
2
(0,9926), indicando 99,2% de ajuste da resposta. Na tabela 5.4. observa-se
que o modelo manteve-se significativo, com valor de Fisher de 78,31 e Lack of
Fit não significativo (p>0,05). A probabilidade de p-valor inferior a 0,0001
CAPÍTULO 5: Resultados e Discussões
Danielle da Silveira dos Santos
118
indicou igualmente que o modelo foi altamente significativo e que os dados
experimentais obtidos estão em um bom ajuste com o modelo. Todos os três
parâmetros avaliados (relação sólido: líquido, carga enzimática e concentração
célular) foram significativos e foram mantidas no modelo. Embora, dentre as
três interações existentes, apenas a interação AB (relação sólido: líquido
associada a carga enzimática) foi mantida no modelo, apresentando-se muito
representativa (alto valor de Fisher).
A equação do modelo é apresentada na equação (2):
[Etanol] = +32.60 +16.70 A+13.09 B+ 808.35 C
–
9.28 A
2
–
4.07 B
2
+ 4.48 C
2
+
8.44AB - 5.93 A
3
–
1.33 B
3
–
287.21 C
3
–
516.46 A
2
C + 2.19 ABC (2)
Analisando os valores de soma dos quadrados e média quadrática,
observa-se que a relação sólido:líquido (parâmetro A) teve o efeito mais
significativo, seguida pela carga enzimática (parâmetro B) e, finalmente, a
concentração celular (parâmetro C), que teve menor influência na concentração
Tabela 5.4. Análise de variância da concentração de etanol através do
processo SSF a partir do bagaço de cana pré-tratado por Z. mobilis CP4,
utilizando o Planejamento Experimental de Superfície de Resposta 2
3
,
avaliando a relação sólido:líquido, carga enzimática e concentração celular.
SQ GL MQ F p >F
Modelo
4693,84
12
391,15 78,31
< 0,0001
A
792,07
1
792,07
158,58
< 0,0001
B
486,79
1
486,79
97,46
< 0,0001
C
44,36
1
244,36
48,92
0,0002
A
2
1033,59
1
1033,59
206,94
< 0,0001
B
2
198,37
1
198,37
39,72
0,0004
C
2
76,08
1
76,08
15,23
0,0059
AB
569,53
1
569,53
114,03
< 0,0001
A
3
390,22
1
390,22
78,13
< 0,0001
B
3
19,52
1
19,52
3,91
0,0886
C
3
239,23
1
239,23
47,90
0,0002
A
2
C
244,67
1
244,67
48,99
0,0002
ABC
38,28
1
38,28
7,66
0,0278
Resíduo
34,96
7
4,99
Lack of Fit
9,90
2
4,95 0,99 0,4350
Erro Puro
25,06
5
5,01
Cor Total
4728,80
19
[Etanol]: [R
2
= 0,9926, Adj R
2
= 0,9 799]
Onde, SQ= Soma Quadrática, GL= Grau de Liberdade, MQ= Média
Quadrática, F= Fisher Calculado, p >F= Probabilidade de Fisher. A= relação
sólido:líquido, B= carga enzimática, C= concentração celular.
CAPÍTULO 5: Resultados e Discussões
Danielle da Silveira dos Santos
119
de etanol. A interação entre carga enzimática e concentração celular (BC), bem
como a interação entre relação sólido:líquido e concentração celular (AC) não
tiveram influência significativa na presente análise, com valores de p>F
inferiores a 0,05, e, portanto, foram removidas do modelo.
O aumento da relação sólido:líquido associada ao aumento da carga
enzimática fez com que a eficiência de hidrólise fosse maior e,
consequentemente, gerado uma maior concentração inicial de glicose
disponível no meio. Kim et al. (2008) analisaram o processo de fermentação
SSF e, da mesma maneira, observou que a eficiência de fermentação depende
da concentração inicial de glicose produzida durante a hidrólise enzimática.
A figura 5.7 mostra que a máxima concentração de etanol ocorre quando
a relação sólido:líquido (A) e a carga enzimática (B) estão em seus maiores
níveis, aumentando-se significativamente a partir do ponto central dos dois
parâmetros analisados para os seus níveis mais elevados.
Figuras 5.7. Superfície de resposta mostrando os efeitos combinados da
relação sólido:líquido (parâmetro A) e carga enzimática (parâmetro B) sobre a
concentração de etanol através do processo SSF a partir do bagaço de cana
pré-tratado por Z. mobilis CP4.
CAPÍTULO 5: Resultados e Discussões
Danielle da Silveira dos Santos
120
Embora exista uma tendência para uma curvatura no gráfico de
superfície de resposta referente à concentração de etanol, o valor máximo é
claramente atingido, conforme plotado no gráfico de produtividade volumétrica,
em que a curvatura é muito evidente. Analisando os resultados desta série de
experimentos, constata-se que a hidrólise foi ineficiente quando a carga
enzimática e a relação sólido:líquido eram baixas, assim como quando haviam
altas concentrações de sólidos associados à baixos níveis de carga enzimática,
liberando baixas concentrações de glicose ao meio e, consequentemente,
produzindo baixas concentrações de etanol. Portanto, a carga enzimática deve
aumentar em associação à relação sólido:líquido.
No tocante à produtividade volumétrica, o melhor modelo ajustado
para a análise estatística desta variável de resposta também foi o modelo
cúbico reduzido, uma vez que resultou no melhor valor de R
2
(0,8848).
Segundo a análise da soma dos quadrados e média quadrática, o parâmetro B
(carga enzimática) foi o mais influente, seguido do parâmetro C (concentração
celular). O parâmetro A (relação sólido:líquido) foi o menos influente no modelo
de produtividade volumétrica de etanol (Tabela 5.5).
O Lack of Fit foi mostrado como significativo (p<0,05), porém não
invalidou o modelo, uma vez que os valores preditos estão em conformidade
com os valores experimentais. O modelo hierárquico foi mantido, com os
respectivos parâmetros e interações, visando uma maior análise do decorrer da
fermentação através dos gráficos de superfície de resposta (Figura 5.8).
A figura 5.8 representa o modelo de superfície de resposta para a
otimização de produtividade volumétrica. O efeito da relação sólido:liquido (Fig.
5.8 A) e carga enzimática, mantendo-se a concentração celular no ponto
central, indica claramente que o ponto ótimo para a máxima produtividade
volumétrica é em torno do nível máximo de carga enzimática e do ponto central
da relação sólido liquido. No entanto, quando o processo SSF ocorre em níveis
elevados de sólidos, o tempo de fermentação e a concentração de etanol são
afetados, sendo reduzidos, conforme analisado nos experimentos 4, 6 e 17
(Tabela 5.2). Quando há um aumento no conteúdo de sólidos e a carga
CAPÍTULO 5: Resultados e Discussões
Danielle da Silveira dos Santos
121
enzimática não aumenta proporcionalmente, a hidrólise enzimática ocorre
lentamente e, assim, a liberação de glicose no processo é baixa, reduzindo-se
a concentração de etanol e a produtividade volumétrica, pois a taxa de
fermentação é limitada pela baixa concentração do substrato.
Tabela 5.5. Análise de variância da produtividade volumétrica de etanol
através do processo SSF a partir do bagaço de cana pré-tratado por Z. mobilis
CP4, utilizando o Planejamento Experimental de Superfície de Resposta 2
3
,
avaliando a relação sólido:líquido, carga enzimática e concentração celular.
Onde, SQ= Soma Quadrática, GL= Grau de Liberdade, MQ= Média
Quadrática, F= Fisher Calculado, p >F= Probabilidade de Fisher, A= relação
sólido:líquido, B= carga enzimática, C= concentração celular.
O efeito das interações entre a relação sólido:liquido e a concentração
celular (AC), mantendo-se a carga enzimática em seu ponto central, indica que
a maior produtividade volumétrica ocorre nos níveis máximos de concentração
celular e em torno do ponto central para a relação sólido: líquido. Desta forma,
quando a relação sólido:líquido é baixa, a liberação de glicose no processo é
igualmente reduzida, fazendo com que baixas concentrações deste açúcar
sejam disponíveis no meio de fermentação e, consequentemente, com que a
concentração de etanol e de produtividade volumétrica diminuam. Além disso,
observou-se que quando haviam concentrações elevadas de sólidos, sem
proporcional aumento de carga enzimática, o mesmo não era hidrolisado por
completo, mantendo-se baixas as concentrações de glicose disponíveis no
SQ GL MQ F p >F
Modelo 4,63
10
0,46 6,92 0,0038
A
0,14
1
0,14
2,11
0,1800
B
1,14
1
1,14
16,97
0,0026
C
0,79
1
0,79
11,85
0,0074
A
2
1,60
1
1,60
23,96
0,0009
B
2
0,87
1
0,87
12,94
0,0058
C
2
0,43
1
0,43
6,47
0,0315
AB
0,011
1
0,011
0,16
0,7011
AC
5,513E-003
1
5,513E-003
0,082
0,7806
BC
0,025
1
0,025
0,38
0,5538
ABC
0,050
1
0,050
0,74
0,4116
Resíduo
0,60
9
0,067
Lack of Fit
0,60
4
0,15
242,90
<0,0001
Erro Puro 3,083E-003
5
6,167E-004
Cor Total
5,23
19
Produtividade Volumétrica: [R
2
= 0,8848, R
2
Aj = 0,7569]
CAPÍTULO 5: Resultados e Discussões
Danielle da Silveira dos Santos
122
meio, conforme os experimentos 4, 6 e 17 (Tabela 5.2). A relação sólido:
líquido em seus níveis ótimos, quando associada a altas concentrações de
células, proporcionou aumento de produtividade volumétrica de etanol.
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