Tabela 4.12. Processo de adaptação metabólica mediante 25 ciclos
fermentativos, variando as concentrações de hidrolisado ácido proveniente do
bagaço de cana e mantendo a concentração de glicose em 20 g/L.
Ciclos
Tempo (Dias)
Hidrolisado (%)
1-5
14
2,5
6-10
20
5
11-15
25
10
16-20
20
15
21-25
20
20
CAPÍTULO 4: Materiais e Métodos
Danielle da Silveira dos Santos
103
Conforme descrito por Nghuyem et al. (1996), citado no item 2.8.4.5; na
medida em que os ciclos de repiques sucessivos são realizados, as
concentrações de hidrolisado ácido se elevam e as de glicose são mantidas de
acordo com o meio RMG.
II. Processo de propagação mediante diferentes estratégias de
aclimatação celular
Com o objetivo de investigar o efeito da aclimatação celular durante a
conversão de glicose e xilose oriundas das frações celulósicas e hemicelulósicas
em etanol, respectivamente, foram utilizadas quatro diferentes estratégias de
propagação celular para obtenção do inoculo a ser adicionado nos frascos e
posterior execução do processo SSCF.
Cabe ressaltar que ensaios prévios avaliando a adição de diferentes
concentrações de hidrolisado (5%, 10%, 20%, 30%, 40%) em meio sintético
complementar, baseados nos estudos de Borges (2011) levaram-nos a
estabelecer as concentrações empregadas no processo de aclimatação. Todo
processo de aclimatação foi desenvolvido a partir de um pré-inóculo inicial,
crescido em meio RMGX; sendo que todas as etapas posteriores, descritas a
seguir, foram realizadas em meio RMG, uma vez que a xilose presente no meio
sintético foi substituída pela xilose oriunda da fração hemicelulósica.
a. Sem aclimatação: a propagação celular ocorreu usando meio sintético
RMGX sem aclimatação; em seguida, 10% (v/v) do meio fermentado
anteriormente durante 48 h foram transferidos para o meio RMG contendo
10% de hidrolisado. As três etapas seguintes referem-se ao procedimento de
aclimatação celular em meio contendo hidrolisado;
b. Duas etapas (Estratégia 1- aclimatação de 5% a 10% de hidrolisado): a
propagação celular ocorreu em um frasco cônico com 200 mL de meio
contendo 5% de hidrolisado; posteriormente 10% (v/v) do meio fermentado
anteriormente durante 48 h foram transferidos para o meio contendo 10% de
hidrolisado;
c. Duas etapas (Estratégia 2- aclimatação de 5% a 20% de hidrolisado): a
propagação ocorreu em um frasco cônico contendo 5% de hidrolisado em
CAPÍTULO 4: Materiais e Métodos
Danielle da Silveira dos Santos
104
meio; posteriormente 10% (v/v) do meio fermentado anteriormente durante 48
h foram transferidos para o meio contendo 20% de hidrolisado;
d. Três etapas (Estratégia 3- aclimatação inicial de 5% e 10%, seguida da
propagação em 20% de hidrolisado e posterior centrifugação): esta estratégia
foi desenvolvida após as aclimatações descritas anteriormente, ou seja, dois
diferentes frascos cônicos contendo 200 mL de meio RMG com diferentes
concentrações de hidrolisado, 5% e 10%, foram inoculados em meio contendo
20% de hidrolisado, com 10% (v/v) do meio fermentado anteriormente.
Porém, em seguida, as culturas foram centrifugadas (4000 rpm/10 min),
atingindo a concentração de aproximadamente 4,0 g/L e, então, ressuspensas
no meio de fermentação contendo 20% de hidrolisado (Figura 4.10).
Figura 4.10.
Diagrama de blocos indicando a estratégia empregada para aclimatação
celular, a qual envolve 3 etapas: inóculos em meio RMG adicionado de 5% e 10% de
hidrolisado hemicelulósico; seguidos de crescimento em meio RMG adicionado de 20%
de hidrolisado hemicelulósico; e posterior concentração de células através de
centrifugação, a serem inoculadas na proporção definida de RMG adicionado de 20% de
hidrolisado hemicelulósico. Onde: (a) pré-inóculo crescido em meio RMGX; (b) inóculo
crescido em meio RMG, contendo 5% (v/v) de hidrolisado hemicelulósico; (c) inóculo
crescido em meio RMG, contendo 10% (v/v) de hidrolisado hemicelulósico; (d)
concentração de células (4000 rpm, 10 minutos), atingindo 4 g/L; (f) ressuspensão em
meio RMG, contendo 20% (v/v) de hidrolisado hemicelulósico.
III. Avaliação da produção de etanol a partir do processo SSCF
através de planejamentos experimentais sequenciais
O processo foi desenvolvido em frascos
cônicos de 500 mL contendo 200
mL de meio de fermentação, que apresentava a mesma composição do meio de
propagação, com exceção da adição de glicose e xilose, que foram substituídas
pelo hidrolisado da celulose e da hemicelulose provenientes do bagaço de cana,
respectivamente, ricos nestes açúcares.
CAPÍTULO 4: Materiais e Métodos
Danielle da Silveira dos Santos
105
As fermentações ocorreram nas seguintes condições: 12 horas de pré-
hidrólise enzimática, 10% (v/v) de inoculo (aclimatado segundo a estratégia
citada anteriormente que resultou em melhores resultados de produção de
biomassa celular), temperatura de 30
o
C, agitação de 150 rpm, suplementação
com meio RM, bem como diferentes concentrações de sólidos e hidrolisado
hemicelulósico do bagaço de cana. Tais concentrações foram avaliadas de
acordo com a execução de
dois planejamentos experimentais compostos
centrais 2
2
, visando buscar por valores ótimos de produção de etanol através do
processo SSCF (Tabelas 4.13 e 4.14).
Tabela 4.13. Variáveis independentes do primeiro planejamento experimental:
percentual de hidrolisado hemicelulósico e relação sólido:líquido (g:mL) do
bagaço de cana, avaliando a produção de etanol pelo processo SSCF 1.
PARÂMETROS
Níveis
-
-
0
+
+
A
Hidrolisado (%)
9,6
20
45
70
80,4
B
Sólido:líquido (g/mL)
0,8
1
1,5
2
2,2
Tabela 4.14. Variáveis independentes do segundo planejamento experimental
avaliando o percentual de hidrolisado ácido, bem como a relação sólido:líquido
(g:mL) do bagaço de cana no que tange à produção de etanol pelo processo
SSCF 2.
PARÂMETROS
Níveis
-
-
0
+
+
A
Hidrolisado (%)
0,7
6,5
20,5
34,5
40,3
B
Sólido:líquido (g/mL)
1,01:10 1,3:10
2:10
2,7:10
2,99:10
4.5. PRODUÇÃO DE ETANOL EM BIORREATOR INSTRUMENTADO
ATRAVÉS DOS PROCESSOS SSF E SSCF
Os ensaios em biorreator (BIOFLO III, New Brunswick) foram realizados
após a determinação das melhores condições estabelecidas nos experimentos
em frascos agitados, utilizando-se células crescidas (No processo SSF, as
células foram centrifugadas; no SSCF, as células foram adicionadas na
proporção de 10% v/v) (Figura 4.11).
O volume nominal e de trabalho do biorreator instrumentado é de 1,5 litros
e 500 mL, respectivamente, velocidade de agitação de 150 rpm, temperatura de
CAPÍTULO 4: Materiais e Métodos
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106
30°C e pH 5, sendo monitorado através de um eletrodo de pH esterilizado e
controlado pela adição de KOH 1M.
Figura 4.11. Experimento em biorreator BIOFLO III (New
.
Brunswick).
4.6. MÉTODOS ANALÍTICOS
4.6.1. DETERMINAÇÃO DE ETANOL E AÇÚCARES POR CLAE
Em todos os experimentos foram retiradas alíquotas de 2 mL, com rigor
asséptico, em média, a cada três horas. No decorrer dos experimentos, tais
amostras foram devidamente tratadas através de centrifugação (11300 g por 10
minutos), filtradas em membrana de acetato de celulose 0,22 µm e
adequadamente diluídas para quantificação por CLAE (Figura 4.12).
Figura 4.12. Sistema cromatrográfico CLAE com detecção por índice refração.
CAPÍTULO 4: Materiais e Métodos
Danielle da Silveira dos Santos
107
Foram determinadas as concentrações de glicose, celobiose e etanol,
utilizando o sistema cromatográfico (WATERS) composto por uma coluna HPX-
87P (Bio-Rad), operante a 80°C com fluxo de 0,6 mL/min de fase móvel (água
MILLIQ), bomba WATERS 510, detector de índice de refração WATERS 410
com software Empower. Os padrões de glicose, celobiose e etanol foram
utilizados nas concentrações de 5 g/L, 10 g/L e 15 g/L, respectivamente.
4.6.2. QUANTIFICAÇÃO DO MICRORGANISMO
O meio contendo a massa celular, após centrifugação em microcentrífuga
(UNIVERSAR IGR HETTICH) a 11.300g/min, foi separado da massa celular. O
sedimentado foi posteriormente ressuspendido em água destilada e as células
quantificadas
pela
medida
da
absorbância
em
espectrofotômetro
(SPECTRUMLAB 22PC) a 600 nm, segundo Leal (1998). As absorbâncias
medidas foram correlacionadas com os valores de massa seca de células
através das curvas-padrão apresentadas na tabela 4.15. A determinação da
massa seca de células foi feita após filtração em membrana Millipore (0,22
m),
seguida de secagem em balança de infravermelho (Sartorius- LJ16) e pesagem
até massa constante.
Tabela 4.15. Curvas padrão de absorbância versus concentração da massa
celular para as linhagens de Z. mobilis.
LINHAGEM
CORRELAÇÃO
Z. mobilis AG11 nativa
Abs = 2,875 * concentração celular (R²= 0,992)
Z. mobilis CP4 nativa
Abs = 1,959 * concentração celular (R²= 0,994)
Z. mobilis CP4 Recombinante
1
Abs = 4,016 * concentração celular (R²= 0,923)
Z. mobilis CP4 Recombinante
2
Abs = 2,608* concentração celular (R²= 0,923)
Onde: 1. Sem adaptação metabólica; 2. Após 26 ciclos adaptativos.
4.7
.
ANÁLISE DOS RESULTADOS
4.7.1. ESTATÍSTICA
Os efeitos estimados das variáveis e condições de processo sobre a
concentração final de etanol (variável de resposta) foram analisados em um
intervalo de 90% de confiança, mediante a Análise de Variância (ANOVA) e
Metodologia de Superfície de Resposta, através do Software Design Expert
Software (versão 7.1.6. Stat-Ease, Inc., Minneapolis, EUA).
CAPÍTULO 4: Materiais e Métodos
Danielle da Silveira dos Santos
108
4.7.2. CÁLCULO DE EFICIÊNCIA
A eficiência de produção de etanol é medida de acordo com a quantidade
de etanol produzido/1 g de substrato consumido (expressos em porcentagem), a
partir do valor de Y
p/s
teórico.
Cálculo de eficiência:
100
)
(
)
(
/
/
x
teórico
Y
processo
Y
E
S
P
S
P
f
4.7.3. TAXA INSTANTÂNEA ESPECÍFICA DE CRESCIMENTO
Durante o intervalo de tempo (dt), o aumento de números de
microrganismos (dx), na fase exponencial, onde as células absorvem os
nutrientes, sintetizando seus constituintes, crescendo e se duplicando, pode ser
representado por:
X
μ
dt
dX
dt
dX
.
X
1
μ
T
dt
LnX
d.
μ
(Equação 4.2)
Onde:
μ
é a taxa específica de crescimento por unidade de tempo =
μ
x
(taxa específica de crescimento, na fase exponencial). Ao plotar o gráfico Ln X
versus Tempo, a tangente a cada ponto da curva obtida fornece o valor de
μ
,
durante a fase exponencial de crescimento. Analogamente, as taxas específicas
para formação de produto e consumo de substrato, em g/g.h, são representados
por:
dt
dP
.
X
q
p
1
e
dt
dS
.
X
q
s
1
(Equação 4.3)
Os valores das taxas de crescimento celular (r
x
), de consumo de substrato
(r
g
), formação de produto (r
p
) foram obtidas plotando-se a concentração celular,
substrato ou produto com o tempo.
(Equação 4.1)
CAPÍTULO 4: Materiais e Métodos
Danielle da Silveira dos Santos
109
4.7.4. TEMPO DE DUPLICAÇÃO
Tempo de geração (tg) que é o tempo de duplicação da massa celular
pode ser representado por:
Ln 2X
0
/X
0
=
x
t
g
t
g
= Ln 2 /
x
t
d
= 0,693/
x
(Equação 4.4)
4.7.5. VARIÁVEIS DE RESPOSTA
Os parâmetros próprios de processos de fermentação foram considerados
da seguinte forma:
a) Fator de rendimento de produção de etanol (g/g)
Sendo:
P:
Concentração final de etanol (g/L)
P
o
:
Concentração inicial de etanol (g/L)
S
:
Concentração final de substrato (g/L)
S
o
:
Concentração inicial de substrato (g/L)
b) Fator de rendimento para crescimento celular (g/g)
Sendo:
X:
Concentração final de biomassa (g/L)
X
o
:
Concentração inicial de biomassa (g/L)
S:
Concentração final de substrato (g/L)
S
o
:
Concentração inicial de substrato (g/L)
c) Produtividade volumétrica (g/L.h)
Sendo:
P:
Concentração final de etanol (g/L)
P
o
:
Concentração inicial de etanol (g/L)
t
f
:
Tempo de fermentação (h)
(Equação 4.7)
f
o
P
t
P
P
Q
(Equação 4.6)
S
S
X
X
S
X
Y
o
o
S
X
/
S
S
P
P
S
P
Y
o
o
S
P
/
(Equação 4.5)
CAPÍTULO 5: Resultados e Discussões
Danielle da Silveira dos Santos
110
_____________________CAPÍTULO 5
RESULTADOS E DISCUSSÃO
O presente capítulo foi destinado à exposição e discussão dos
resultados referentes às linhagens de Zymomonas mobilis naturalmente
ocorrentes, assim como a modificada geneticamente. Tais resultados foram
obtidos a partir da conclusão dos experimentos planejados para elaboração da
tese. Nos estudos sobre a otimização dos parâmetros operacionais foram
desenvolvidos planejamentos experimentais sequenciais e os efeitos de
impacto sobre a variável de resposta foram analisados a partir de metodologias
de superfície de resposta, definindo as condições ótimas para a condução do
processo.
CAPÍTULO 5: Resultados e Discussões
Danielle da Silveira dos Santos
111
5.1. ENSAIOS DE FERMENTAÇÃO EMPREGANDO A BACTÉRIA
Zymomonas mobilis NATURALMENTE OCORRENTE
5.1.1. Desempenho das linhagens nativas frente à utilização de glicose e
xilose
Visando avaliar a capacidade de consumo dos principais açúcares
encontrados nas frações polissacarídicas de resíduos de composição
lignocelulósica, nomeadamente glicose e xilose, realizou-se um ensaio, em
meio sintético, com as duas linhagens de Z. mobilis.
Os perfis cinéticos que representam o desempenho de ambas as
linhagens estão apresentados nas figuras que se seguem. Analisando o gráfico
da cinética de Z. mobilis AG11 (Figura 5.1), observa-se que o substrato foi
consumido em um período de 15 horas. O desempenho da linhagem Z. mobilis
CP4 foi similar, no entanto, o tempo para o consumo total da glicose foi
ligeiramente superior (18 horas) (Figura 5.2).
Figura 5.1. Cinética de consumo de glicose, produção de etanol e crescimento
celular pela linhagem de Z. mobilis AG11.
CAPÍTULO 5: Resultados e Discussões
Danielle da Silveira dos Santos
112
Figura 5.2. Cinética de consumo de glicose, produção de etanol e crescimento
celular pela linhagem de Z. mobilis CP4.
Conforme sinalizado pela literatura, células de Z. mobilis apresentam
reduzido crescimento, destinando grande parte do substrato para a síntese de
etanol; contudo, observa-se, em ambas as linhagens, uma associação do
crescimento celular com a produção de etanol. Rogers et al. (1982) já haviam
reportado que apenas 2% do carbono encontrado na molécula do substrato são
convertidos à plasticidade celular.
As variáveis medidas e calculadas desta série de experimentos foram
reunidas e estão apresentadas na tabela 5.1.
Tabela 5.1. Desempenho das linhagens AG11 e CP4 de Z.mobilis na
fermentação de glicose (concentração inicial de 20 g/L).
Variáveis medidas e calculadas
AG11
CP4
Etanol (g/L)
7,5
6,3
Células (g/L)
0,48
0,43
Produtividade (g/L.h)
0,50
0,33
Taxa específica de crescimento (h
-1
)
0,147
0,169
Fator de conversão em produto (Y
P/S
), em g.g
-1
0,255
0,106
Fator de conversão em células (Y
X/S
), em g.g
-1
0,024
0,019
Eficiência de fermentação (%)
54
22
Tempo de duplicação (h)
4,7
4,1
CAPÍTULO 5: Resultados e Discussões
Danielle da Silveira dos Santos
113
Pode-se constatar, que em meio sintético, ambas as linhagens
apresentaram resultados semelhantes quanto à produção de etanol e
crescimento celular. Embora, a linhagem AG11 tenha apresentado valores
ligeiramente superiores de produtividade volumétrica e fatores de conversão
tanto de células quanto de produto, a linhagem CP4 exibiu valor superior para a
taxa específica de crescimento.
Na Figura 5.3 observa-se um cromatograma típico de início de
fermentação por Z. mobilis CP4, no qual a glicose apresenta-se em altas
concentrações e a produção de etanol é iniciada, verificando-se, ainda, a
presença de alguns subprodutos.
Figura 5.3. Perfil cromatográfico típico da fermentação por Z.mobilis.
No tocante ao consumo de xilose, foi constatada a incapacidade de
ambas as linhagens nativas em metabolizar esta pentose. Não houve
crescimento celular, assim como não houve produção de etanol, conforme
mostrado na figura 5.4.
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