2.7.
ESTRATÉGIAS DE PROCESSO PARA PRODUÇÃO DE
ETANOL DE SEGUNDA GERAÇÃO
Após
os
pré-tratamentos
(ácido
e
alcalino)
dos
materiais
lignocelulósicos, que visam o fracionamento da hemicelulose e a
deslignificação do resíduo sólido (celulignina), é possível hidrolisar a celulose
através de concepções modernas, que incluem processos enzimáticos para a
obtenção de glicose, que, por sua vez, poderá ser fermentada a etanol (LYND
et al., 2002). Diferentes configurações de processos podem ser definidas com
base nesses eventos e de acordo com a integração dos mesmos, que se
seguem detalhadas.
2.7.1. HIDRÓLISE ENZIMÁTICA SEPARADA DA FERMENTAÇÃO (SHF)
Nesta concepção, como o próprio nome indica os materiais pré-
tratados são hidrolisados enzimaticamente para obtenção da glicose, a qual é
subsequentemente fermentada a etanol. Os eventos acontecem em unidades
separadas fisicamente (Figura 2.16).
A grande vantagem desse método é que o mesmo permite que tanto a
hidrólise quanto a fermentação sejam conduzidas em condições ótimas para
cada etapa. A temperatura ótima para as celulases está entre 45 e 50
o
C e a
temperatura ideal para a fermentação está entre 30 e 37
o
C (OLSSON et al.,
2006).
No entanto, cabe ressaltar que a maior desvantagem deste processo
está relacionada à inibição das enzimas do complexo celulásico pelos seus
produtos finais de hidrólise (glicose e celobiose); assim como a possibilidade
de contaminação, pois o tempo envolvido na etapa de hidrólise é longo, e a
CAPÍTULO 2: Revisão Bibliográfica
Danielle da Silveira dos Santos
51
solução de açúcares formada torna-se uma fonte disponível ao ataque de
microrganismos indesejados. Além disso, as próprias enzimas podem ser
uma fonte potencial de contaminação (TAHERZADEH & KARIMI, 2007).
Figura 2.16. Diagrama de blocos do processo de hidrólise enzimática separada
da fermentação (SHF). Fonte: PEREIRA JR et al. apud WINGREEN (2008).
2.7.2. HIDRÓLISE ENZIMÁTICA E FERMENTAÇÃO SIMULTÂNEAS (SSF)
Esta concepção combina a hidrólise enzimática dos materiais pré-
tratados e a fermentação em um único evento (Figura 2.17).
Figura 2.17. Diagrama de blocos do processo de hidrólise enzimática e
fermentação simultâneas (SSF). Fonte: PEREIRA JR et al. apud WINGREEN
(2008).
CAPÍTULO 2: Revisão Bibliográfica
Danielle da Silveira dos Santos
52
Sua maior vantagem é que a glicose produzida através da atividade
das celulases é imediatamente consumida pelo microrganismo fermentador,
minimizando os efeitos inibitórios causados pela glicose, que se apresenta em
baixas concentrações. Além disso, há um aumento de produtividade em
etanol, pois menores cargas enzimáticas são utilizadas no processo; assim
como há redução do risco de contaminação, pois a presença de etanol reduz
essa possibilidade (McMILLAN et al., 1999).
Entretanto, estes processos são conduzidos fora das condições ótimas
de operação das enzimas, de modo que um ganho de rendimento devido à
menor inibição enzimática pode ser contrabalançado por uma menor atividade
das enzimas em razão das condições operacionais menos apropriadas à
atividade catalítica. Microrganismos termotolerantes têm sido propostos para
serem usados neste processo, dessa forma, seria possível aproximar a
temperatura do processo à temperatura ótima de atividade das celulases
(TAHERZADEH & KARIMI, 2007).
Embora exerça um menor efeito inibitório que a glicose ou a celobiose
sobre a taxa de hidrólise, a presença de etanol na celulignina pré-tratada
provoca um acentuado decréscimo da atividade enzimática durante o
processo hidrolítico. Há registros de que concentrações de etanol de 30 g/L
reduziriam a atividade enzimática em 25% (WU & LEE, 1997).
Apesar de algumas desvantagens, este tem sido o método preferido
tanto em estudos de laboratório quanto em escala piloto. Da mesma forma
que na concepção anterior, os açúcares provenientes da hemicelulose após o
pré-tratamento podem ser convertidos a etanol em um fermentador separado
(TAHERZADEH & KARIMI, 2007).
2.7.3. HIDRÓLISE ENZIMÁTICA E CO-FERMENTAÇÃO SIMULTÂNEAS
(SSCF)
Esta concepção refere-se à co-fermentação de ambos os açúcares,
pentoses e hexoses, em uma mesma etapa (Figura 2.18). Neste sentido, o
hidrolisado hemicelulósico e a celulose não são separados após a etapa de
pré-tratamento, permitindo que os açúcares da hemicelulose sejam
CAPÍTULO 2: Revisão Bibliográfica
Danielle da Silveira dos Santos
53
convertidos a etanol juntamente com a sacarificação e fermentação da
celulose (TEIXEIRA et al., 2000).
É necessária a intervenção da Biologia Molecular, visando conferir a
um único microrganismo as características necessárias para fermentar ambos
os açúcares. Existem vários exemplos na literatura de microrganismos
engenheirados com essa finalidade, dentre os quais se encontra Zymomonas
mobilis (LAWFORD & ROUSSEAU, 1998; McMILLAN et al., 1999; TEIXEIRA
et al., 2000; AGRAWAL et al., 2011; ZHOU, et al., 2011).
Figura 2.18. Diagrama de blocos do processo de sacarificação e co-fermentação
simultâneas (SSCF). Fonte: PEREIRA JR et al. apud WINGREEN (2008).
2.7.4. BIOPROCESSO CONSOLIDADO (BPC)
Esta concepção de processo une em uma mesma etapa a produção de
celulases, a hidrólise enzimática de celulose e a fermentação de pentoses e
hexoses por um mesmo microrganismo (Figura 2.19).
Figura 2.19. Diagrama de blocos do processo consolidado para a produção
de etanol de segunda geração (BPC).
Fonte: PEREIRA JR et al. apud
WINGREEN (2008).
A adoção desta estratégia tecnológica permitiria uma significativa
redução nos custos de produção, além de representar uma alternativa à
CAPÍTULO 2: Revisão Bibliográfica
Danielle da Silveira dos Santos
54
estratégia convencional de produção de celulases em uma etapa, com o uso
das enzimas resultantes para a hidrólise da celulose em uma segunda etapa.
Em termos de custos e de desenvolvimento tecnológico, a estratégia
do Bioprocesso Consolidado (BPC) apresenta-se como a ideal a ser atingida.
Contudo, esse tipo de processo ainda não pode ser desenvolvido à nível
industrial com os microrganismos disponíveis atualmente, tais como
Clostridium thermocellum e Clostridium cellulolyticum, necessitando-se do
desenvolvimento de contínuas técnicas de engenharia genética para a
construção de linhagens que possuam maiores níveis de expressão tanto de
atividade enzimática quanto de fermentação (OLSON et al., 2012).
2.7.5. PRODUÇÃO DE ETANOL DE SEGUNDA GERAÇÃO POR Z. mobilis
Nas últimas décadas, diversos estudos têm sido realizados visando à
utilização de biomassa residual como matéria-prima para produção de
bioetanol. A bactéria Z. mobilis vem sendo empregada em alguns trabalhos,
devido à sua alta capacidade de produzir etanol em condições anaeróbicas.
A tabela 2.5 sumariza os resultados mais proeminentes reportados na
literatura utilizando linhagens de Zymomonas mobilis nativa ou engenheirada
geneticamente, visando à produção de etanol de segunda geração.
Yamashita et al. (2008) avaliaram a utilização de altas concentrações
de
“
lodo de papel
”
na produção de etanol através do processo SSF, por
células de Z. mobilis inicialmente livres, não havendo nenhuma produção de
etanol através desta estratégia de operação do processo. O resultado foi
atribuído à grande quantidade de íons metálicos presentes no hidrolisado de
papel. Sendo assim, as bactérias foram imobilizadas em alginato de cálcio,
resultando na produção de etanol de 18 g/L em 4 corridas.
Recentemente, alguns autores avaliam a fermentação a partir do
bagaço de cana. Velmurugan et al. (2012) estudaram o processo SSF a partir
deste resíduo por Z. mobilis MTCC89, alcançando 91,2% de eficiência de
produção de etanol em 36 horas. Kuo & Lee (2008) avaliaram o pré-
tratamento desta matéria-prima através de óxido de n-metilmorfolina e, em
seguida, também empregaram o processo SSF, atingindo a concentração
CAPÍTULO 2: Revisão Bibliográfica
Danielle da Silveira dos Santos
55
14,5 g/L de etanol por tal bactéria. Fu et al. (2009) analisaram a fermentação
do hidrolisado ácido do bagaço por células de Z. mobilis imobilizadas em
alginato de cálcio, associadas a células de Pichia stipitis, atingindo cerca de
28 g/L de etanol.
Tabela 2.5. Resultados relatados na literatura para a produção de etanol de
segunda geração por Zymomonas mobilis.
Onde: MP: matéria-prima; xil: xilose; gli: glicose; fru: frutose; sac: sacarose; gal:
galactose; cel: celobiose; ART: açúcares redutores totais; SR: sistema reacional; FA:
frascos agitados; BR: biorreator; Q
P
: produtividade volumétrica em etanol; X
0
:
concentração inicial de células, P: etanol (g/L). Referências Bibliográficas: 1. FU et al.
(2009); 2. DAVIS et al. (2005); 3. YAMASHITA et al. (2008); 4. KUO & LEE (2008);
5.YANASE et al. (2005); 6. MOHAGHEGHI et al. (2004); 7. VELMURUGAN et al. (2012).
Wirawan et al. (2012) compararam a imobilização de Z. mobilis em
alginato de cálcio e em álcool polivinílico, onde os melhores resultados
obtidos foram de 6,24 g/L e 5,52 g/L de etanol, eficiência de fermentação de
79,09% e 69,96%, produtividade volumétrica de 3,04 g.L/h e 2,37 g.L/h,
utilizando o processo SHF e de 5,53 g/L e 5,44 g/L de etanol, eficiência de
fermentação de 70,09% e 68,95%, produtividade volumétrica de 1,31 g.L/h e
1,27 g.L/h, utilizando o processo SSF para a produção de etanol,
respectivamente. Os estudos mostraram boa estabilidade e possibilidade de
MP/Meio
Substrato
X
o
SR
P (g/L)
Q
P
(g/L.h)
Ref.
Hidrolisado de
bagaço de cana
32 g/L de gli;
21 g/L de xil
1x10
8
CFU/mL
BR
28
0,7
1
Vinhoto de trigo
Hidrolisado ácido,
suplementado com
40 g/L de gli
0,2 g/L
FA
28 g/L
1,55
2
Lodo de Papel
200 g/L de resíduo
de papel
0,01 g
BR
18
0,372
3
Bagaço de cana
15 g/L de gli
1,5 g/L
BR
14,5
0,29
4
Materiais
lignocelulósicos
10% de gli e 20 g/L
de cel
10
7
/ml
-1
FA
10,7
0,22
5
Hidrolisado ácido
do milho
75 g/L de gli;
52 g/L de xil
0,06 g/L
BR
53
0,073
6
Bagaço de cana
38,4 g/L de gli
0,1 g
-
17,9
0,497
7
CAPÍTULO 2: Revisão Bibliográfica
Danielle da Silveira dos Santos
56
reutilização das células nas fermentações em batelada simples e alimentada,
tanto para a imobilização em alginato de cálcio quanto em álcool polivinílico.
Estudos prévios sobre a co-imobilização de diferentes microrganismos
foram desenvolvidos recentemente por Liu et al. (2012). Os autores
empregaram fungos da espécie Trichoderma reesei e Aspergillus niger,
produtores de celulases, juntamente com a bactéria Zymomonas mobilis,
produtora de etanol. Desta forma, o material celulósico foi convertido a
açúcares através das enzimas do complexo celulásico e, posteriormente,
fermentado pela bactéria. Após 96 horas de co-cultivo das duas espécies dos
fungos filamentosos na proporção 1/1, inóculo de 18% (m/v), os mesmos
obtiveram uma taxa de produção de açúcar redutor e de eficiência de hidrólise
de 2,57 g/L e 46,27%, respectivamente. A concentração de etanol alcançada
foi de 0,56 g/L a partir de carboximetilcelulose (CMC), promovendo uma
eficiência de fermentação de 11,2% após o período de 24 horas.
2.8. PRODUÇÃO DE ETANOL A PARTIR DE PENTOSES POR
LINHAGENS RECOMBINANTES DE Zymomonas mobilis
Para viabilizar a produção comercial do etanol lignocelulósico faz-se
necessária a eficiente e integral conversão dos carboidratos potenciais em
bioetanol. Embora a fermentação da glicose seja realizada com eficiência pela
bactéria Zymomonas mobilis, bem como por Saccharomyces cerevisiae, o
mesmo não ocorre com as pentoses, principais componentes da fração
hemicelulósica.
Segundo Zhang & Lynd (2010), o emprego de
microrganismos fermentadores de glicose e xilose aumentou em 19% a
produção de etanol através do processo SSCF de resíduos de papel, quando
comparada à produção apenas da glicose oriunda da fração celulósica.
2.8.1. METABOLIZAÇÃO DA XILOSE
A busca de microrganismos fermentadores de xilose é, pois, um dos
maiores desafios da Biotecnologia moderna. Conforme citado nos itens 2.6 e
2.7, a bactéria gram-negativa Zymomonas mobilis apresenta diversas
características interessantes para este propósito, contudo, a mesma só é
capaz de fermentar um pequeno espectro de açúcares, glicose, sacarose e
CAPÍTULO 2: Revisão Bibliográfica
Danielle da Silveira dos Santos
57
frutose. Além disso, tal microrganismo não possui algumas enzimas-chave da
via das pentoses, que permitem o metabolismo da xilose. Desta forma, a
engenharia metabólica em Z. mobilis apresenta-se como alternativa para
tornar esta bactéria capaz de fermentar pentoses, além de hexoses.
A figura 2.20 ilustra a inserção da via das pentoses na via de Entner-
Doudoroff, após a adição de genes que codificam para as enzimas xilose
isomerase, xiluloquinase, transaldolase e transquetolase na bactéria Z.
mobilis (ZHANG et al., 1995).
Figura 2.20. Metabolismo da xilose, inserido na via Entner-Doudoroff do
microrganismo Z. mobilis. Fonte: AGRAWAL et al. (2011).
CAPÍTULO 2: Revisão Bibliográfica
Danielle da Silveira dos Santos
58
Neste contexto, o rendimento teórico ocorre em 0,51 g de etanol/ g de
xilose (1,67 mol/mol), havendo formação de 1 mol ATP/mol de pentose.
Aristidou & Penttilä (2000) indicaram que a nova via metabólica promove a
conversão de 5 moles de etanol a partir de 3 moles de xilose, conforme a
seguinte equação estequiométrica:
3 xilose + 3ADP + 3 Pi
5 etanol + 5CO
2
+ 3ATP + 3H
2
O.
2.8.1.1. Breve Histórico
Os trabalhos pioneiros de Liu et al. (1988) e Feldman et al. (1992), que
introduziram os genes da xilose isomerase (XI) e xiluloquinase (XK),
provenientes de Xanthomonas capestris e Klebsiella pneumoniae em Z.
mobilis tiveram pouco sucesso. Tais enzimas são responsáveis pela
assimilação da xilose, no entanto, as enzimas transaldolase (TAL) e
transquetolase (TKT) promovem a metabolização da mesma, sendo
essenciais para a produção de etanol (MATSUSHIKA et al., 2012).
Os mesmos genes codificadores destas enzimas, provenientes de E.
coli, também foram introduzidos na bactéria Zymobacter palmae. Após
adaptação metabólica em meio contendo xilose, o microrganismo atingiu 95%
de eficiência de fermentação a partir de glicose e xilose (YANASE et al.,
2007), resultado superior ao reportado por Mohagheghi et al. (2006), que
alcançaram 76% de eficiência, com o consumo de 75% (m/v) da pentose
proveniente de hidrolisado hemicelulósico por Z. mobilis. Desta forma, Zhang
et al. (1995) demonstraram que a co-expressão de XI, XK, TAL e TKT,
oriundas de Escherichia coli, permitiram que Z. mobilis co-fermentasse xilose
e glicose, atingindo 11 g/L de etanol e conversão em produto de 0,44 g/g
xilose, correspondendo à uma eficiência de fermentação de 86%. Já a partir
de glicose, e de hexose/ pentose, a linhagem recombinante CP4 (pZB5)
atingiu 94% e 95% de eficiência, durante 16 e 30 horas, respectivamente.
Posteriormente, estudos avaliaram o emprego de diferentes linhagens
de Zymomonas mobilis quanto à produção de etanol e ao crescimento celular.
O grupo de pesquisa do NREL empregou a linhagem ATCC31821 (pZB5), no
intuito de alcançar maiores rendimentos, comparativamente a estudos
CAPÍTULO 2: Revisão Bibliográfica
Danielle da Silveira dos Santos
59
utilizando a linhagem CP4 (pZB5). Os resultados indicaram que a linhagem
ATCC31821 fermentou 1,5% (m/v) de glicose e 3,5% (m/v) de xilose, sem
controle de pH, nas temperaturas de 30 e 37
o
C, respectivamente, alcançando
99 e 96% (m/v) de consumo dos açúcares (12 e 18% a mais do que a
linhagem CP4); 20 e 18% de aumento nos valores de produtividade
volumétrica, assim como 49 e 40% de aumento na taxa de conversão destes
carboidratos frente à linhagem CP4, durante 69 horas (ZHANG et al., 1995;
ZHANG et al., 2003).
Recentemente, estudos de Zhang & Lynd (2010) indicaram que o
microrganismo Z. mobilis 8b (derivada da 31821-pZB5) apresentou melhor
desempenho frente à levedura S. cerevisiae RWB222, quanto à hidrólise e co-
fermentação simultâneas de resíduos do papel, onde ambas as espécies
atingiram 40 g/L de etanol na temperatura de 37
o
C. Contudo, a bactéria e a
levedura reduziram a viabilidade celular após 44 e 25 horas de processo, em
concentrações de 29 e 23 g/L de etanol, atingindo 0,47 e 0,40 g/ produto/g
açúcares consumido, respectivamente.
Diversos artigos reportam sobre a fermentação da xilose presente na
fração hemicelulósica de resíduos agro-industriais. Mohagheghi et al. (2004)
utilizaram o hidrolisado ácido de resíduos do processamento do milho, cuja
fermentação resultou na concentração de etanol de 53 g/L. Davis et al. (2006)
compararam o desempenho de Z. mobilis e de S. cerevisiae em hidrolisado
de
amido,
apresentando
produtividades
de
4,90
e
3,25
g/L.h,
respectivamente, mostrando que tal bactéria recombinante apresentou-se
mais promissora do que a levedura quanto à produtividade em etanol. Davis
et al. (2005) também fizeram uso do hidrolisado hemicelulósico proveniente
de grãos de trigo, composto por 6 g/L de glicose e 16 g/L de xilose, sendo
adicionado de 10 g/L desta hexose, alcançando 11 g/L de etanol e 12 g/L de
xilose residual pela linhagem ZM4 (pZB5). Em estudos posteriores, os autores
suplementaram o meio com 5 g/L de extrato de levedura e 40 g/L de glicose,
obtendo 28 g/L de etanol e 2,6 g/L de xilose residual após o período de 18
horas. Adicionalmente, Joachimshtal & Rogers (1999) também ressaltaram a
CAPÍTULO 2: Revisão Bibliográfica
Danielle da Silveira dos Santos
60
importância da adição desta fonte de nitrogênio, assim como da glicose na
fermentação por Z. mobilis recombinante.
A figura 2.21 mostra o mapa do plasmídeo pZMETX, desenvolvido pelo
grupo de pesquisa de Agrawal et al. (2011), os quais empregaram dois
operons para a assimilação da xilose, sob o controle do promotor de Z.
mobilis piruvato decarboxilase (Ppdc), e, para a metabolização desta pentose,
o promotor enolase (Peno).
Figura 2.21 Mapa do plasmídeo
pZMETX. Onde: Ppdc, promotor piruvato
decarboxilase; Peno, promotor enolase; xylA, xilose isomerase; xylB,
xilulokinase; talB, transaldolase; tklB/tktA, transquetolase; CmR, gene de
resistência ao clorofenicol; ZM27, origem de replicação de Z. mobilis; p15a,
origem de replicação de E. coli.
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