Figura 2.13. Atuação sinérgica das celulases. BG:
β
-Glicosidases, CBH:
Celobiohidrolases, EG: Endoglucanases, R: Terminal redutor, NR: Terminal
não redutor. Fonte: USDOE (2003).
O acúmulo gradativo dos produtos finais da hidrólise enzimática, como a
celobiose e a glicose, resulta na inibição da atividade das próprias enzimas do
complexo celulásico. Vários métodos têm sido desenvolvidos com o intuito de
contornar essa problemática, incluindo a utilização de elevadas concentrações
enzimáticas, a suplementação de β
-glucosidases durante a hidrólise, bem
como a adoção da estratégia de sacarificação e fermentação simultâneas (SUN
& CHENG, 2002).
Dentre os diversos fatores que podem afetar a hidrólise enzimática estão
incluídos: tamanho de partícula, porosidade do material, presença de fibras
CAPÍTULO 2: Revisão Bibliográfica
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31
cristalinas na celulose, assim como presença de Iignina e de hemicelulose, as
quais dificultam o acesso da enzima à celulose, resultando na redução da
eficiência do processo de hidrólise. Neste contexto, a relação sólido:líquido, a
atividade das celulases, as condições de reação (tempo, temperatura e pH), as
quais normalmente são amenas, bem como a composição do meio específico e
o tempo de fermentação também apresentam grande importância no processo
enzimático (SUN & CHENG, 2002; OLIVEIRA & VASCONCELOS, 2006).
De acordo com Baudel (2006), a disponibilidade da glicose oriunda da
celulose, em termos de custo global, rendimento glicosídico e fermentabilidade
do hidrolisado apresenta-se como um obstáculo no que tange à viabilização
econômica da produção do bioetanol proveniente de resíduos lignocelulósicos.
Desta forma, a técnica de reciclo enzimático aumentaria o rendimento de
hidrólise, reduzindo consideravelmente o custo do processo, porém, cabe
ressaltar que a eficiência de hidrólise diminui gradativamente a cada reciclo
(XIN, 1993).
2.6. A BACTÉRIA Zymomonas mobilis
Cosmopolita, a bactéria Z. mobilis encontra-se em áreas tropicais da
América, Ásia e África. Esta bactéria foi originalmente descoberta em
fermentações com seivas de plantas ricas em açúcar, como a seiva do agave
no México e em vinho de palmáceas. Foi identificada como contaminante em
melaço, em cidras e em cervejas produzidas em países da Europa. Hoje em
dia, produzem-se bebidas alcoólicas de sucos de frutas por fermentação mista
com Zymomonas sp. associada a leveduras (VIIKARI & LINKO, 1986; LIEGH et
al.,
1985; O’MULLEN
et al., 1991).
2.6.1. BREVE HISTÓRICO
Os primeiros estudos sobre Zymomonas mobilis datam do início do
século XX. Em 1911, esta bactéria foi isolada por Baker e Hillier a partir da
cidra, uma bebida produzida pela fermentação do suco de maçã, que
freqüentemente se deteriorava e apresentava sinais característicos como
CAPÍTULO 2: Revisão Bibliográfica
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32
formação de espuma, liberação de gases e aumento da acidez, gerando um
líquido turvo, com depósito no fundo da garrafa (SWINGS & DE LEY, 1977).
Contudo, a descoberta da bactéria é comumente atribuída a Lindner, que
a isolou no México, em 1924, a partir da seiva fermentada do Agave atrovirens,
conhecida como pulque, uma bebida alcoólica de 4 a 6% em etanol, dando à
bactéria o nome de Thermobacterium mobile (CHANG et al., 1981;
MONTENECOURT, 1985; PARKER et al.,1995). Em 1931, Kluyver e
Hoppenbrouwers modificaram o nome da bactéria para Pseudomonas lindneri,
devido a sua semelhança bioquímica com a família Pseudomonadaceae.
Somente em 1936, Kluyver e van Nielr criaram o gênero Zymomonas e
deram o nome de Zymomonas mobilis à bactéria, por existirem maiores
diferenças do que similaridades com essa família (PARKER et al.,1995). Em
1937, Shimwell isolou Zymomonas sp. durante a primeira etapa de
fermentação da cevada, na elaboração da cerveja e lhe deu o nome provisório
de Achromobacter anaerobium.
Na década de 50, esta bactéria chamou a atenção dos bioquímicos por
utilizar uma via metabólica semelhante à utilizada por microrganismos
estritamente aeróbios, como os do gênero Pseudomonas. Em 1950, lhe deram
o nome de Saccharomonas sp. e em seguida, foi denominada como
Zymomonas anaerobia (VIIKARI & KORHOLA, 1986). Em 1956, já havia sido
reportada como: A. anaerobium e T. mobile. Neste período, já era conhecida a
sua capacidade de produzir levana, um polímero de frutose, que possui
diversas utilidades na indústria alimentícia. Nos anos 70, esta bactéria foi
apontada como a mais rápida e eficiente produtora de etanol, empregando
sacarose, glicose ou frutose como únicas fontes de carbono e energia (DOELE
et al., 1993).
No Brasil, a pesquisa com Z. mobilis foi iniciada pelo pesquisador
Gonçalves de Lima em 1952, quando trouxe do México a cepa AG11. Em
1970, este pesquisador isolou as linhagens CP1, CP2, CP3 e CP4 de amostras
de caldo de cana-de-açúcar ligeiramente degradadas. A linhagem conhecida
CAPÍTULO 2: Revisão Bibliográfica
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33
como CP4 foi mundialmente distribuída e tem sido detectada como
contaminante nas indústrias de fermentação alcoólica (ABUD, 2005).
2.6.2. CARACTERÍSTICAS GERAIS
Zymomonas mobilis é uma bactéria Gram-negativa, não patogênica que
engloba apenas uma espécie, dividida em duas subespécies: Zymomonas
mobilis subespécie mobilis e Zymomonas mobilis subespécie pomaceae
(SWINGS & DE LEY, 1977).
Estas bactérias podem ocorrer isoladamente, embora seja mais comum
sua ocorrência aos pares (Figura 2.14). Não possuem cápsulas e não formam
esporos e, em sua grande maioria, não possuem mobilidade (algumas
linhagens perderam a mobilidade, embora cerca de 30% são móveis). Suas
células p
ossuem a forma de bastonetes com 2 a 6 μm de comprimento e de 1 a
1,5 μm de largura, com extremidades arredondadas, possuindo de 1 a 4
flagelos polares. As colônias apresentam coloração branca ou creme,
crescentes em temperaturas em torno de 30°C (FALCÃO DE MORAIS, 1983).
Figura 2.14. Linhagem Zymomonas mobilis CP4. Fonte: PALHA (2002).
O crescimento celular ocorre na faixa de pH variando de 3,5 a 7,5,
embora a faixa ótima seja entre 5 a 7. Muitas linhagens crescem a pH 3,5 e 4,
igualmente como ocorre com as bactérias acéticas, que apresentam habilidade
de crescimento em valores de pH entre 4 e 4,5 (SWINGS & DE LEY, 1977;
SCHMIDT et al., 1986; ERZINGER & VITOLO, 2006).
CAPÍTULO 2: Revisão Bibliográfica
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34
Desta forma, as bactérias do gênero Zymomonas se assemelham à
maioria das bactérias acéticas, por apresentarem rápido consumo de glicose,
ciclo de Krebs incompleto, ocorrência do mecanismo de Entner Doudoroff e, no
caso das linhagens que possuem mobilidade, por apresentarem flagelos
polares. Além disso, estes microrganismos ocorrem em plantas e preferem
crescer em nichos ricos em sucos de plantas, tolerando um pH baixo. Apesar
de sua alta capacidade fermentativa, Zymomonas mobilis apresenta funções de
cadeia de transporte de elétrons e bom crescimento em ambientes
microaeróbicos, ocupando uma posição taxonômica claramente próxima dos
organismos aeróbios Glucanobacter e Acetobacter (SPRENGER, 1996).
Algumas linhagens de Zymomonas, assim como a maioria das bactérias
acéticas são hábeis em crescer em meio contendo 20% de glicose.
Adicionalmente, grande parte destas linhagens é hábil em crescer em meio
contendo 40% de
glicose, de forma semelhante a muitas bactérias acéticas,
que são capazes de crescer rapidamente em um meio contendo 50% de
glicose. No vinho da palma, é a principal bactéria tolerante ao alto conteúdo de
glicose, frutose, sacarose e, em consequência, ao conteúdo alcoólico, assim
como também ocorre no caldo de cana-de-açúcar e no mel de abelhas
(VIIKARI & LINKO, 1986).
As bactérias do gênero Zymomonas possuem mecanismos de
adaptação para crescer em presença de etanol. Esses mecanismos incluem a
alteração da composição da sua membrana lipídica, evitando assim a
penetração de etanol no interior da célula, aumentando-se as propriedades da
barreira hidrofóbica e diminuindo a perda de material intracelular. Em níveis
acima do máximo tolerável, o álcool atua na dissolução da membrana
citoplasmática, de composição fosfolipídica, afetando a sua fluidez e
aumentando a sua permeabilidade, resultando no fluxo de íons, cofatores e
coenzimas para o meio exterior (SCHMIDT et al., 1986).
2.6.2.1. Biologia molecular básica de Zymomonas mobilis
O genoma da bactéria Zymomonas mobilis apresenta cerca de 1,53 ±
0,19.10
9
Da, 56% do tamanho do genoma de Escherichia coli podendo
CAPÍTULO 2: Revisão Bibliográfica
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35
acomodar cerca de 1500 cístrons, bem como 48,5 ± 1,0% de composição das
bases nitrogenadas G e C. Alguns genes presentes no microrganismo em
estudo apresentam destaque em relação à possível origem genética. Neste
contexto, o gene adh (40 kDa), o Gap (36,1 kDa) e o phoC (29 kDa)
apresentam homologias com o Adh IV de S. cereviseae (SWINGS & DE LEY,
1977), com microrganismos termofílicos, e com isoenzimas de cloroplasto
(POND et al., 1989); assim como semelhança com genes de E. coli, e com
sequências reguladoras de S. cerevisae. A organização dos genes trp é
semelhante à encontrada em espécies de Rhizobium, calcoaceticus
Acinetobacter, Pseudomonas e acidoovorans (CONWAY et al., 1987). Cabe
ressaltar que 50% das proteínas celulares existentes nesta bactéria
correspondem às enzimas responsáveis pelo processo fermentativo.
2.6.3. CARACTERÍSTICAS CULTURAIS
2.6.3.1. Zymomonas mobilis X Saccharomyces cerevisiae
O interesse em Zymomonas mobilis tem sido reavivado nos últimos
anos, devido às vantagens de sua utilização sobre a tradicional levedura
Saccharomyces cerevisiae, como o seu alto rendimento de conversão de
açúcar a etanol e sua elevada produtividade. Esse microrganismo possui um
enorme potencial para utilização na produção de etanol combustível,
apresentando valores de produtividade específica (g etanol/g células. h) 3 a 5
vezes maior quando comparados aos obtidos com a tradicional levedura, bem
como um rendimento em etanol a partir de glicose próximo ao máximo
obtenível pela estequiometria (97%) (SPRENGER, 1996; BAI et al., 2007).
Contudo, cabe ressaltar que a bactéria possui baixa tolerância a inibidores,
bem como pequeno espectro de utilização de açúcares fermentáveis.
Na África e na Ásia, a bactéria Z. mobilis ocupa uma posição similar à
que a tradicional levedura ocupa na Europa e na América. Z. mobilis consegue
catabolizar o substrato com altas taxas específicas, pois o seu balanço de
energia resulta na formação de uma molécula de ATP por glicose metabolizada
durante a fermentação alcoólica (que equivale à metade da quantidade
produzida pela levedura). Desta forma, há produção de baixos rendimentos de
CAPÍTULO 2: Revisão Bibliográfica
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36
biomassa durante a fermentação, pois apenas cerca de 2% da glicose é
utilizada como fonte de carbono. O tempo de geração é relativamente rápido,
variando de 90 a 120 minutos (OSMAN et al., 1985; CONWAY et al., 1987;
SWINGS & DE LEY, 1977). Outra diferença entre os dois microrganismos
ocorre em suas rotas metabólicas. A bactéria executa uma simples rota
catabólica,
sem
alternativas
metabólicas
encontradas
em
outros
microrganismos.
O microrganismo Z. mobilis também se diferencia da levedura pelo maior
crescimento em anaerobiose e, portanto, não necessita de controle de oxigênio
para manter sua viabilidade em cultivo contínuo. Além disso, a bactéria tolera
elevadas concentrações de glicose, fermenta etanol em níveis maiores
(especialmente em cultivo continuo), produzindo elevadas concentrações deste
produto (GUNASEKARAN & RAJ,1999).
Portanto, as simples condições para seu crescimento, o baixo
rendimento celular, a formação de poucos produtos secundários, facilidade de
manipulação genética, a alta tolerância a açúcares, resistência a temperaturas
próximas de 40
o
C, resistência a altas concentrações de etanol, em até 120 g/L
(ARISTIDOU & PENTTILÄ, 2000; LEE & ROGERS, 1983) e 140 g/L (DIEN et
al., 2003), assim como a possível utilização na alimentação animal tornam
Zymomonas mobilis um potencial concorrente às tradicionais leveduras (DIEN
et al., 2003; LIMAYEM & RICKE, 2012), em particular para a produção de
etanol 2G .
2.6.3.2. Outras habilidades
Esta bactéria já demonstrou diversas outras habilidades: produção de
levana, produção de substâncias antimicrobianas (CALAZANS, 1997) e
desenvolvimento
de
probióticos
(culturas
de
microrganismos
vivos
administrados a humanos e/ou animais para fins terapêuticos). Além da
produção de substâncias de maior valor agregado, como sais de gliconato,
sorbitol e levana, concomitantemente à produção de etanol (ALVES, 1993;
FONSECA, 2003).
CAPÍTULO 2: Revisão Bibliográfica
Danielle da Silveira dos Santos
37
Clavijero (1968), em seu livro intitulado “A História do México”, r
elata o
uso pelos astecas do “aguamiel” (seiva açucarada do
agave), considerada o
habitat natural da Zymomonas mobilis, como agentes terapêuticos no
tratamento de diversas doenças, tais como distúrbios intestinais (ABUD, 2005).
Adicionalmente, a utilização do caldo fermentado por este microrganismo vem
sendo muito estudada para o tratamento de diversas outras doenças: Lindner
(1928) menciona a utilização de soluções contendo células de Zymomonas
mobilis no tratamento de doenças contra a febre aftosa, brucelose e doenças
renais em bovinos, assim como no tratamento de furúnculos e feridas
purulentas, distúrbios ginecológicos e intestinais (como colites crônicas
resistentes a medicamentos quimioterápicos e antibióticos) em seres humanos
(GONÇALVES DE LIMA, 1958; FALCÃO DE MORAIS, 1993; ABUD, 2005).
2.6.4. UTILIZAÇÃO DE AÇÚCARES
As bactérias da espécie Zymomonas mobilis são quimioorganotróficas,
ou seja, utilizam fontes de carbono orgânicas, como glicose, frutose ou
sacarose, para seu crescimento, gerando quantidades praticamente
equimolares de etanol e CO
2.
Estes carboidratos são indispensáveis na
composição do meio de cultura de Zymomonas mobilis. Porém, é com a
utilização da glicose que se tem melhores resultados em relação à produção de
etanol (CAMÊLO, 2009).
As características únicas do metabolismo de Z. mobilis têm atraído
considerável interesse de pesquisadores, servindo como modelo para as
investigações sobre o fluxo glicolítico e sua regulação. A glicose é
metabolizada em uma taxa extraordinariamente alta, onde, a cada minuto, tal
bactéria consome concentrações deste açúcar equivalentes a um terço de sua
biomassa; uma vez que, somente cerca de 2% são utilizados para a
plasticidade celular, compensando o seu baixo rendimento energético. Desta
forma, a hexose é transportada por um sistema de difusão facilitada de alta
velocidade, baixa afinidade e sem dependência energética (DOELLE & KIRK,
1993; PARKER et al., 1997).
CAPÍTULO 2: Revisão Bibliográfica
Danielle da Silveira dos Santos
38
Seo et al. (2005) atribuem a sua rápida e elevada produção de etanol à
presença de duas enzimas, álcool desidrogenase, juntamente com piruvato
descarboxilase. Teoricamente, estas bactérias podem fermentar 1 mol de
glicose a quase 1,8 a 1,9 moles de etanol, 1,8 moles de CO
2
, 0,15 moles de
ácido acético e pequena quantidade de outros subprodutos, como lactato,
acetaldeído, glicerol, acetoína, dihidroxicetona, sorbitol, manitol e ácido
glicônico, seguindo um balanço metabólico simples (BERTASSO, 1996).
2.6.5. ROTA METABÓLICA
O metabolismo de açúcares em células de Zymomonas mobilis (Figura
2.15), assim como em algumas bactérias Gram-negativas, incluindo
Rhizobium, Pseudomonas e Agrobacterium, ocorre através da via de
Entner
–
Doudoroff (SPRENGER, 1996).
Figura 2.15. Via metabólica de formação de produtos da fermentação de carboidratos
por Zymomonas mobilis. 1. glucoquinase; 2. glicose 6-P-desidrogenase; 3. 6-P-
gluconolactonase; 4. 6-P-gluconato desidratase; 5. aldolase; 6. gliceraldeído P-
desidrogenase; 7. fosfoglicerato quinase; 8. fosfoglicerato mutase; 9. enolase; 10.
piruvato quinase; 11. frutoquinase; 12. glicose 6-P isomerase; 13. glicose-frutose
oxidoredutase (GFOR); 14. gluconolactonase (GL); 15. gluconato quinase; 16. piruvato
descarboxilase; 17. álcool desidrogenase. Fonte: SPRENGER (1996).
CAPÍTULO 2: Revisão Bibliográfica
Danielle da Silveira dos Santos
39
Nesta via, a partir de cada molécula de glicose há a produção de duas
moléculas de NADPH e uma molécula de ATP, que serão utilizadas nas
reações biossintéticas celulares (SPRENGER, 1996). Dessa forma, a glicose é
transportada do meio para o interior da célula, sendo fosforilada a glicose-6-
fosfato através da enzima glucoquinase. Em seguida, é formada a molécula de
glucono-6-fosfato
lactona, através da desidrogenação pela enzima glicose-6-
fosfato desidrogenase (que age na presença da coenzima NADP).
A molécula de glucono-6-fosfato
lactona sofre reação de hidratação,
através da enzima 6-fosfato gluconolactonase, e, com isso, ocorre a formação
da molécula 6-fosfogluconato, que é desidratada pela enzima 6-fosfogluconato
desidratase e forma a molécula 2-ceto-3-desoxi-fosfogluconato. Esta é
hidrolisada, através da enzima aldolase, ocorrendo à formação de outras duas
moléculas: gliceraldeído-3-fosfato ou piruvato.
A molécula de gliceraldeído-3-fosfato pode ser utilizada na síntese de
componentes celulares ou sofrer as mesmas transformações da rota de
Embder-Meierhopf-Parnas (EMP), na sua conversão para piruvato. Este
importante intermediário sofre descarboxilação, reação catalisada pela enzima
piruvato descarboxilase (requer Mg
++
e tiamina pirofosfato como co-fatores),
gerando acetaldeído e dióxido de carbono através de reação irreversível.
Finalmente o acetaldeído é reduzido a etanol. A enzima álcool desidrogenase é
comum a muitos microorganismos; porém, a enzima piruvato descarboxilase é
a enzima-chave desta via, pois direciona o fluxo de piruvato para etanol, além
de ser pouco encontrada em bactérias (CAMÊLO, 2009).
Adicionalmente, a GFOR foi identificada como sendo uma enzima
periplasmática relativamente abundante na bactéria em estudo. A mesma
pertence à categoria enzimática em que a oxidorredução é realizada com
NADP não dissociável (ZHANG & CHEN, 2009).
2.6.6. FORMAÇÃO DE SUBPRODUTOS
A conversão de sacarose ou de misturas de glicose e frutose a etanol
pela bactéria Z. mobilis é significantemente inferior à obtida pela glicose ou
frutose separadamente, atingindo apenas cerca de 70% do valor teórico. Este
CAPÍTULO 2: Revisão Bibliográfica
Danielle da Silveira dos Santos
40
fato ocorre, pois a frutose formada da hidrólise da sacarose não é
primariamente transportada para o interior das células via difusão facilitada,
mas sim utilizada na formação de levana, sorbitol e fruto-oligômeros,
subprodutos de alto valor agregado (DWIDAR et al., 2012).
A síntese da levana é dependente dos monossacarídeos livres,
especialmente a frutose formada após a hidrólise da sacarose. Neste contexto,
a concentração de sacarose decresce no meio de cultura, enquanto que a
glicose e a frutose geradas se acumulam no mostro, sendo posteriormente
absorvidas pela bactéria (DOELLE & KIRK, 1993).
Uma vez que a taxa de consumo da glicose é mais rápida que a da
frutose, geralmente a mesma se acumula em maiores
quantidades, sendo
posteriormente reduzida a sorbitol, enquanto a glicose é oxidada (KANNAN et
al., 1997). Desta forma, tal composto, assim como o ácido glucônico, é formado
por monômeros de frutose, sendo obtido equimolarmente em reação catalisada
por glicose-frutose oxidorredutase (GFOR) e glucono-
δ
-lactonase (GL),
enzimas periplasmáticas de Zymomonas mobilis.
Adicionalmente, Loss et al. (1994) reportaram que a formação do sorbitol
é conseqüência de um mecanismo de proteção osmótica, quando as células se
encontram sob o estresse de altas concentrações de açúcares. Desta forma,
este soluto compatível funciona como um osmoprotetor para o microrganismo,
que o acumula intracelularmente até concentrações de 1M, visando compensar
os efeitos exercidos pela alta pressão osmótica externa.
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