Ocorrente e recombinante, empregando

2.7.
 
ESTRATÉGIAS  DE  PROCESSO  PARA  PRODUÇÃO  DE 
ETANOL DE SEGUNDA GERAÇÃO 
Após 
os 
pré-tratamentos 
(ácido 
e 
alcalino) 
dos 
materiais 
lignocelulósicos,  que  visam  o  fracionamento  da  hemicelulose  e  a 
deslignificação do resíduo sólido (celulignina), é possível hidrolisar a celulose 
através de concepções modernas, que incluem processos enzimáticos para a 
obtenção de glicose, que, por sua vez, poderá ser fermentada a etanol (LYND 
et al., 2002). Diferentes configurações de processos podem ser definidas com 
base  nesses  eventos  e  de  acordo  com  a  integração  dos  mesmos,  que  se 
seguem detalhadas. 
2.7.1.  HIDRÓLISE ENZIMÁTICA SEPARADA DA FERMENTAÇÃO (SHF)  
Nesta  concepção,  como  o  próprio  nome  indica  os  materiais  pré-
tratados são hidrolisados enzimaticamente para obtenção da glicose, a qual é 
subsequentemente fermentada a etanol. Os eventos acontecem em unidades 
separadas fisicamente (Figura 2.16).  
A grande vantagem desse método é que o mesmo permite que tanto a 
hidrólise  quanto a  fermentação  sejam  conduzidas  em  condições ótimas  para 
cada etapa. A temperatura ótima para as celulases está entre 45 e 50
o
C e a 
temperatura  ideal  para a  fermentação  está  entre  30  e  37
o
C  (OLSSON  et  al., 
2006). 
No  entanto,  cabe  ressaltar  que  a  maior  desvantagem  deste  processo 
está  relacionada  à  inibição  das  enzimas  do  complexo  celulásico  pelos  seus 
produtos finais de hidrólise (glicose e celobiose); assim como a possibilidade 
de  contaminação,  pois  o  tempo  envolvido  na  etapa  de  hidrólise  é  longo,  e  a 

CAPÍTULO 2: Revisão Bibliográfica 
 
 
 
Danielle da Silveira dos Santos 
 
51 
solução  de  açúcares  formada  torna-se  uma  fonte  disponível  ao  ataque  de 
microrganismos  indesejados.  Além  disso,  as  próprias  enzimas  podem  ser 
uma fonte potencial de contaminação (TAHERZADEH & KARIMI, 2007).  
 
Figura 2.16. Diagrama de blocos do processo de hidrólise enzimática separada 
da fermentação (SHF). Fonte: PEREIRA JR et al. apud WINGREEN (2008). 
2.7.2.  HIDRÓLISE ENZIMÁTICA E FERMENTAÇÃO SIMULTÂNEAS (SSF) 
Esta  concepção  combina  a  hidrólise  enzimática  dos  materiais  pré-
tratados e a fermentação em um único evento (Figura 2.17).  
 
Figura  2.17.  Diagrama  de  blocos  do  processo  de  hidrólise  enzimática  e 
fermentação  simultâneas  (SSF).  Fonte:  PEREIRA  JR  et  al.  apud  WINGREEN 
(2008). 

CAPÍTULO 2: Revisão Bibliográfica 
 
 
 
Danielle da Silveira dos Santos 
 
52 
Sua  maior  vantagem  é  que  a  glicose  produzida  através  da  atividade 
das  celulases  é  imediatamente  consumida  pelo  microrganismo  fermentador, 
minimizando os efeitos inibitórios causados pela glicose, que se apresenta em 
baixas  concentrações.  Além  disso,  há  um  aumento  de  produtividade  em 
etanol,  pois  menores  cargas  enzimáticas  são  utilizadas  no  processo;  assim 
como há redução do risco de contaminação, pois a presença de etanol reduz 
essa possibilidade (McMILLAN et al., 1999).  
Entretanto, estes processos são conduzidos fora das condições ótimas 
de  operação  das  enzimas,  de  modo  que  um  ganho  de  rendimento  devido  à 
menor inibição enzimática pode ser contrabalançado por uma menor atividade 
das  enzimas  em  razão  das  condições  operacionais  menos  apropriadas  à 
atividade  catalítica.  Microrganismos  termotolerantes  têm  sido  propostos  para 
serem  usados  neste  processo,  dessa  forma,  seria  possível  aproximar  a 
temperatura  do  processo  à  temperatura  ótima  de  atividade  das  celulases 
(TAHERZADEH & KARIMI, 2007). 
Embora exerça um menor efeito inibitório que a glicose ou a celobiose 
sobre  a  taxa  de  hidrólise,  a  presença  de  etanol  na  celulignina  pré-tratada 
provoca  um  acentuado  decréscimo  da  atividade  enzimática  durante  o 
processo  hidrolítico.  Há  registros  de  que  concentrações  de  etanol  de  30  g/L 
reduziriam a atividade enzimática em 25% (WU & LEE, 1997).  
Apesar  de  algumas  desvantagens,  este  tem  sido  o  método  preferido 
tanto  em  estudos  de  laboratório  quanto  em  escala  piloto.  Da  mesma  forma 
que na concepção anterior, os açúcares provenientes da hemicelulose após o 
pré-tratamento podem ser convertidos a etanol em um fermentador separado 
(TAHERZADEH & KARIMI, 2007). 
2.7.3.   HIDRÓLISE  ENZIMÁTICA  E  CO-FERMENTAÇÃO  SIMULTÂNEAS 
(SSCF) 
Esta  concepção  refere-se  à  co-fermentação  de  ambos  os  açúcares, 
pentoses  e  hexoses,  em  uma  mesma  etapa  (Figura  2.18).  Neste  sentido,  o 
hidrolisado  hemicelulósico  e  a  celulose  não  são  separados  após  a  etapa  de 
pré-tratamento,  permitindo  que  os  açúcares  da  hemicelulose  sejam 

CAPÍTULO 2: Revisão Bibliográfica 
 
 
 
Danielle da Silveira dos Santos 
 
53 
convertidos  a  etanol  juntamente  com  a  sacarificação  e  fermentação  da 
celulose (TEIXEIRA et al., 2000). 
É  necessária  a  intervenção  da  Biologia  Molecular,  visando  conferir  a 
um único microrganismo as características necessárias para fermentar ambos 
os  açúcares.  Existem  vários  exemplos  na  literatura  de  microrganismos 
engenheirados com essa finalidade, dentre os quais se encontra Zymomonas 
mobilis (LAWFORD & ROUSSEAU, 1998; McMILLAN  et al., 1999; TEIXEIRA 
et al., 2000; AGRAWAL et al., 2011; ZHOU, et al., 2011). 
 
Figura 2.18. Diagrama de blocos do processo de sacarificação e co-fermentação 
simultâneas (SSCF). Fonte: PEREIRA JR et al. apud WINGREEN (2008). 
2.7.4.  BIOPROCESSO CONSOLIDADO (BPC) 
Esta concepção de processo une em uma mesma etapa a produção de 
celulases,  a  hidrólise  enzimática  de  celulose  e  a  fermentação  de pentoses  e 
hexoses por um mesmo microrganismo (Figura 2.19).  
 
Figura  2.19.  Diagrama  de  blocos  do  processo  consolidado  para  a  produção 
de  etanol  de  segunda  geração  (BPC). 
Fonte:  PEREIRA  JR  et  al.  apud 
WINGREEN (2008).
 
A  adoção  desta  estratégia  tecnológica  permitiria  uma  significativa 
redução  nos  custos  de  produção,  além  de  representar  uma  alternativa  à 

CAPÍTULO 2: Revisão Bibliográfica 
 
 
 
Danielle da Silveira dos Santos 
 
54 
estratégia convencional de produção de celulases em  uma etapa, com o uso 
das enzimas resultantes para a hidrólise da celulose em uma segunda etapa.  
Em  termos  de  custos  e  de  desenvolvimento  tecnológico,  a  estratégia 
do Bioprocesso Consolidado (BPC) apresenta-se como a ideal a ser atingida. 
Contudo,  esse  tipo  de  processo  ainda  não  pode  ser  desenvolvido  à  nível 
industrial  com  os  microrganismos  disponíveis  atualmente,  tais  como 
Clostridium  thermocellum  e  Clostridium  cellulolyticum,  necessitando-se  do 
desenvolvimento  de  contínuas  técnicas  de  engenharia  genética  para  a 
construção de linhagens que possuam  maiores níveis de expressão tanto de 
atividade enzimática quanto de fermentação (OLSON et al., 2012). 
2.7.5.  PRODUÇÃO DE ETANOL DE SEGUNDA GERAÇÃO POR Z. mobilis 
Nas  últimas  décadas,  diversos  estudos  têm  sido  realizados  visando  à 
utilização  de  biomassa  residual  como  matéria-prima  para  produção  de 
bioetanol.  A  bactéria  Z.  mobilis  vem  sendo  empregada  em  alguns  trabalhos, 
devido  à  sua  alta  capacidade  de  produzir  etanol  em  condições  anaeróbicas.  
A  tabela  2.5  sumariza  os  resultados  mais  proeminentes  reportados  na 
literatura utilizando linhagens de Zymomonas mobilis nativa ou engenheirada 
geneticamente, visando à produção de etanol de segunda geração.  
Yamashita  et  al.  (2008)  avaliaram  a  utilização  de  altas  concentrações 
de 
“
lodo  de  papel
”
  na  produção  de  etanol  através  do  processo  SSF,  por 
células  de Z.  mobilis  inicialmente livres,  não havendo nenhuma  produção  de 
etanol  através  desta  estratégia  de  operação  do  processo.  O  resultado  foi 
atribuído à grande quantidade de íons metálicos presentes no hidrolisado de 
papel.  Sendo  assim,  as  bactérias  foram  imobilizadas  em  alginato  de  cálcio, 
resultando na produção de etanol de 18 g/L em 4 corridas.  
Recentemente,  alguns  autores  avaliam  a  fermentação  a  partir  do 
bagaço de cana. Velmurugan et al. (2012) estudaram o processo SSF a partir 
deste  resíduo  por  Z.  mobilis  MTCC89,  alcançando  91,2%  de  eficiência  de 
produção  de  etanol  em  36  horas.  Kuo  &  Lee  (2008)  avaliaram  o  pré-
tratamento  desta  matéria-prima  através  de  óxido  de  n-metilmorfolina  e,  em 
seguida,  também  empregaram  o  processo  SSF,  atingindo  a  concentração 

CAPÍTULO 2: Revisão Bibliográfica 
 
 
 
Danielle da Silveira dos Santos 
 
55 
14,5 g/L de etanol por tal bactéria. Fu et al. (2009) analisaram a fermentação 
do  hidrolisado  ácido  do  bagaço  por  células  de  Z.  mobilis  imobilizadas  em 
alginato  de  cálcio,  associadas  a  células  de  Pichia  stipitis,  atingindo  cerca de 
28 g/L de etanol. 
Tabela  2.5.  Resultados  relatados  na literatura  para  a  produção de  etanol  de 
segunda geração por Zymomonas mobilis. 
Onde:  MP:  matéria-prima;  xil:  xilose;  gli:  glicose;  fru:  frutose;  sac:  sacarose;  gal: 
galactose;  cel:  celobiose;  ART:  açúcares  redutores  totais;  SR:  sistema  reacional;  FA: 
frascos  agitados;  BR:  biorreator;  Q
P
:  produtividade  volumétrica  em  etanol;  X
0
: 
concentração  inicial  de  células,  P:  etanol  (g/L).  Referências  Bibliográficas:  1.  FU  et  al. 
(2009);  2.  DAVIS  et  al.  (2005);  3.  YAMASHITA  et  al.  (2008);  4.  KUO  &  LEE  (2008); 
5.YANASE et al. (2005); 6. MOHAGHEGHI et al. (2004); 7. VELMURUGAN et al. (2012). 
   
  
   
Wirawan  et  al.  (2012)  compararam  a  imobilização  de  Z.  mobilis  em 
alginato  de  cálcio  e  em  álcool  polivinílico,  onde  os  melhores  resultados 
obtidos foram de 6,24 g/L e 5,52 g/L de etanol, eficiência de fermentação de 
79,09%  e  69,96%,  produtividade  volumétrica  de  3,04  g.L/h  e  2,37  g.L/h, 
utilizando  o  processo  SHF  e  de  5,53  g/L  e  5,44  g/L  de  etanol,  eficiência  de 
fermentação de  70,09% e 68,95%, produtividade volumétrica de 1,31 g.L/h e 
1,27  g.L/h,  utilizando  o  processo  SSF  para  a  produção  de  etanol, 
respectivamente.  Os  estudos  mostraram  boa  estabilidade  e  possibilidade  de 
MP/Meio 
Substrato 
X
o
 
SR 
P (g/L) 
Q
P 
(g/L.h) 
Ref. 
Hidrolisado de 
bagaço de cana 
32 g/L de gli;  
21 g/L de xil 
1x10
8 
CFU/mL 
BR 
28 
0,7 
1 
Vinhoto de trigo 
Hidrolisado ácido, 
suplementado com 
40 g/L de gli 
0,2 g/L 
FA 
28 g/L 
1,55 
2 
Lodo de Papel 
200 g/L de resíduo 
de papel 
0,01 g 
BR 
18 
0,372 
3 
Bagaço de cana 
15 g/L de gli 
1,5 g/L 
BR 
14,5 
0,29 
4 
Materiais 
lignocelulósicos 
10% de gli e 20 g/L 
de cel 
10
7
/ml
-1
 
FA 
10,7 
0,22 
5 
Hidrolisado ácido 
do milho 
75 g/L de gli;  
52 g/L de xil 
0,06 g/L 
BR 
53 
0,073 
6 
Bagaço de cana 
38,4 g/L de gli 
0,1 g 
- 
17,9 
0,497 
7 

CAPÍTULO 2: Revisão Bibliográfica 
 
 
 
Danielle da Silveira dos Santos 
 
56 
reutilização das células nas fermentações em batelada simples e alimentada, 
tanto para a imobilização em alginato de cálcio quanto em álcool polivinílico.  
Estudos prévios sobre a co-imobilização de diferentes microrganismos 
foram  desenvolvidos  recentemente  por  Liu  et  al.  (2012).  Os  autores 
empregaram  fungos  da  espécie  Trichoderma  reesei  e  Aspergillus  niger, 
produtores  de  celulases,  juntamente  com  a  bactéria  Zymomonas  mobilis, 
produtora  de  etanol.  Desta  forma,  o  material  celulósico  foi  convertido  a 
açúcares  através  das  enzimas  do  complexo  celulásico  e,  posteriormente, 
fermentado pela bactéria. Após 96 horas de co-cultivo das duas espécies dos 
fungos  filamentosos  na  proporção  1/1,  inóculo  de  18%  (m/v),  os  mesmos 
obtiveram uma taxa de produção de açúcar redutor e de eficiência de hidrólise 
de 2,57 g/L e 46,27%, respectivamente. A concentração de etanol alcançada 
foi  de  0,56  g/L  a  partir  de  carboximetilcelulose  (CMC),  promovendo  uma 
eficiência de fermentação de 11,2% após o período de 24 horas.  
2.8.  PRODUÇÃO DE ETANOL  A PARTIR DE PENTOSES POR 
LINHAGENS RECOMBINANTES DE Zymomonas mobilis 
Para  viabilizar  a  produção  comercial  do  etanol  lignocelulósico  faz-se 
necessária  a  eficiente  e  integral  conversão  dos  carboidratos  potenciais  em 
bioetanol. Embora a fermentação da glicose seja realizada com eficiência pela 
bactéria  Zymomonas  mobilis,  bem  como  por  Saccharomyces  cerevisiae,  o 
mesmo  não  ocorre  com  as  pentoses,  principais  componentes  da  fração 
hemicelulósica. 
Segundo  Zhang  &  Lynd  (2010),  o  emprego  de 
microrganismos  fermentadores  de  glicose  e  xilose  aumentou  em  19%  a 
produção de etanol através do processo SSCF de resíduos de papel, quando 
comparada à produção apenas da glicose oriunda da fração celulósica. 
2.8.1.  METABOLIZAÇÃO DA XILOSE 
A  busca  de  microrganismos  fermentadores  de  xilose  é,  pois,  um  dos 
maiores desafios da Biotecnologia moderna. Conforme citado nos itens 2.6 e 
2.7,  a  bactéria  gram-negativa  Zymomonas  mobilis  apresenta  diversas 
características  interessantes  para  este  propósito,  contudo,  a  mesma  só  é 
capaz  de  fermentar  um  pequeno  espectro  de  açúcares,  glicose,  sacarose  e 

CAPÍTULO 2: Revisão Bibliográfica 
 
 
 
Danielle da Silveira dos Santos 
 
57 
frutose. Além disso, tal microrganismo não possui algumas enzimas-chave da 
via  das  pentoses,  que  permitem  o  metabolismo  da  xilose.  Desta  forma,  a 
engenharia  metabólica  em  Z.  mobilis  apresenta-se  como  alternativa  para 
tornar esta bactéria capaz de fermentar pentoses, além de hexoses.  
A  figura  2.20 ilustra  a inserção da  via  das pentoses  na  via  de  Entner-
Doudoroff,  após  a  adição  de  genes  que  codificam  para  as  enzimas  xilose 
isomerase,  xiluloquinase,  transaldolase  e  transquetolase  na  bactéria  Z. 
mobilis (ZHANG et al., 1995).  
 
Figura  2.20.  Metabolismo  da  xilose,  inserido  na  via  Entner-Doudoroff  do 
microrganismo Z. mobilis. Fonte: AGRAWAL et al. (2011).   
 

CAPÍTULO 2: Revisão Bibliográfica 
 
 
 
Danielle da Silveira dos Santos 
 
58 
Neste contexto, o rendimento teórico ocorre em 0,51 g de etanol/ g de 
xilose  (1,67  mol/mol),  havendo  formação  de  1  mol  ATP/mol  de  pentose. 
Aristidou  &  Penttilä  (2000)  indicaram  que  a  nova  via  metabólica  promove  a 
conversão  de  5  moles  de  etanol  a  partir  de  3  moles  de  xilose,  conforme  a 
seguinte equação estequiométrica:  
3 xilose + 3ADP + 3 Pi 

 5 etanol + 5CO
2
+ 3ATP + 3H
2
O.  
2.8.1.1. Breve Histórico 
Os trabalhos pioneiros de Liu et al. (1988) e Feldman et al. (1992), que 
introduziram  os  genes  da  xilose  isomerase  (XI)  e  xiluloquinase  (XK), 
provenientes  de  Xanthomonas  capestris  e  Klebsiella  pneumoniae  em  Z. 
mobilis  tiveram  pouco  sucesso.  Tais  enzimas  são  responsáveis  pela 
assimilação  da  xilose,  no  entanto,  as  enzimas  transaldolase  (TAL)  e 
transquetolase  (TKT)  promovem  a  metabolização  da  mesma,  sendo 
essenciais para a produção de etanol (MATSUSHIKA et al., 2012).   
Os  mesmos  genes  codificadores  destas  enzimas,  provenientes  de  E. 
coli,  também  foram  introduzidos  na  bactéria  Zymobacter  palmae.  Após 
adaptação metabólica em meio contendo xilose, o microrganismo atingiu 95% 
de  eficiência  de  fermentação  a  partir  de  glicose  e  xilose  (YANASE  et  al., 
2007),  resultado  superior  ao  reportado  por  Mohagheghi  et  al.  (2006),  que 
alcançaram  76%  de  eficiência,  com  o  consumo  de  75%  (m/v)  da  pentose 
proveniente de hidrolisado hemicelulósico por Z. mobilis. Desta forma, Zhang 
et  al.  (1995)  demonstraram  que  a  co-expressão  de  XI,  XK,  TAL  e  TKT, 
oriundas de Escherichia coli, permitiram que  Z. mobilis co-fermentasse xilose 
e  glicose,  atingindo  11  g/L  de  etanol  e  conversão  em  produto  de  0,44  g/g 
xilose,  correspondendo  à  uma  eficiência  de  fermentação  de  86%.  Já  a partir 
de  glicose,  e  de  hexose/  pentose,  a  linhagem  recombinante  CP4  (pZB5) 
atingiu 94% e 95% de eficiência, durante 16 e 30 horas, respectivamente.  
Posteriormente,  estudos  avaliaram  o  emprego  de  diferentes linhagens 
de Zymomonas mobilis quanto à produção de etanol e ao crescimento celular. 
O grupo de pesquisa do NREL empregou a linhagem ATCC31821 (pZB5), no 
intuito  de  alcançar  maiores  rendimentos,  comparativamente  a  estudos 

CAPÍTULO 2: Revisão Bibliográfica 
 
 
 
Danielle da Silveira dos Santos 
 
59 
utilizando  a  linhagem  CP4  (pZB5).  Os  resultados  indicaram  que  a  linhagem 
ATCC31821  fermentou  1,5%  (m/v)  de  glicose  e  3,5%  (m/v)  de  xilose,  sem 
controle de pH, nas temperaturas de 30 e 37
o
C, respectivamente, alcançando 
99  e  96%  (m/v)  de  consumo  dos  açúcares  (12  e  18%  a  mais  do  que  a 
linhagem  CP4);  20  e  18%  de  aumento  nos  valores  de  produtividade 
volumétrica, assim como 49 e 40% de aumento na taxa de conversão destes 
carboidratos  frente  à  linhagem  CP4,  durante  69  horas  (ZHANG  et  al.,  1995; 
ZHANG et al., 2003). 
Recentemente,  estudos  de  Zhang  &  Lynd  (2010)  indicaram  que  o 
microrganismo  Z.  mobilis  8b  (derivada  da  31821-pZB5)  apresentou  melhor 
desempenho frente à levedura S. cerevisiae RWB222, quanto à hidrólise e co-
fermentação  simultâneas  de  resíduos  do  papel,  onde  ambas  as  espécies 
atingiram  40  g/L  de  etanol  na  temperatura  de  37
o
C.  Contudo,  a  bactéria  e  a 
levedura reduziram a viabilidade celular após 44 e 25 horas de processo, em 
concentrações  de  29  e  23  g/L  de  etanol,  atingindo  0,47  e  0,40  g/  produto/g 
açúcares consumido, respectivamente. 
Diversos  artigos  reportam  sobre  a  fermentação  da  xilose  presente  na 
fração  hemicelulósica  de  resíduos  agro-industriais.  Mohagheghi  et  al.  (2004) 
utilizaram  o  hidrolisado  ácido  de  resíduos  do  processamento  do  milho,  cuja 
fermentação resultou na concentração de etanol de 53 g/L. Davis et al. (2006) 
compararam  o  desempenho  de  Z.  mobilis  e  de  S.  cerevisiae  em  hidrolisado 
de 
amido, 
apresentando 
produtividades 
de 
4,90 
e 
3,25 
g/L.h, 
respectivamente,  mostrando  que  tal  bactéria  recombinante  apresentou-se 
mais  promissora  do  que  a levedura  quanto  à  produtividade  em  etanol.  Davis 
et  al.  (2005)  também  fizeram  uso  do  hidrolisado  hemicelulósico  proveniente 
de  grãos  de  trigo,  composto  por  6  g/L  de  glicose  e  16  g/L  de  xilose,  sendo 
adicionado de 10 g/L desta hexose, alcançando 11 g/L de etanol e 12 g/L de 
xilose residual pela linhagem ZM4 (pZB5). Em estudos posteriores, os autores 
suplementaram o meio com 5 g/L de extrato de levedura e 40 g/L de glicose, 
obtendo  28  g/L  de  etanol  e  2,6  g/L  de  xilose  residual  após  o  período  de  18 
horas. Adicionalmente, Joachimshtal & Rogers (1999) também ressaltaram a 

CAPÍTULO 2: Revisão Bibliográfica 
 
 
 
Danielle da Silveira dos Santos 
 
60 
importância  da  adição  desta  fonte  de  nitrogênio,  assim  como  da  glicose  na 
fermentação por Z. mobilis recombinante.  
A figura 2.21 mostra o mapa do plasmídeo pZMETX, desenvolvido pelo 
grupo  de  pesquisa  de  Agrawal  et  al.  (2011),  os  quais  empregaram  dois 
operons  para  a  assimilação  da  xilose,  sob  o  controle  do  promotor  de  Z. 
mobilis piruvato decarboxilase (Ppdc), e, para a metabolização desta pentose, 
o promotor enolase (Peno).  
 
Figura  2.21  Mapa  do  plasmídeo 
pZMETX.  Onde:  Ppdc,  promotor  piruvato 
decarboxilase;  Peno,  promotor  enolase;  xylA,  xilose  isomerase;  xylB, 
xilulokinase;  talB,  transaldolase;  tklB/tktA,  transquetolase;  CmR,  gene  de 
resistência  ao  clorofenicol;  ZM27,  origem  de  replicação  de  Z.  mobilis;  p15a, 
origem de replicação de E. coli.