Ocorrente e recombinante, empregando

4
 
(g/L) 
MgS0
4
.7H
2
0 
(g/L) 
Etanol 
(g/L) 
1 
6,25 
1,25 
0,75 
0,75 
38,1 
2 
18,75 
1,25 
0,75 
0,75 
33,5 
3 
6,25 
3,75 
0,75 
0,75 
18,6 
4 
18,75 
3,75 
0,75 
0,75 
14,3 
5 
6,25 
1,25 
2,25 
0,75 
39,3 
6 
18,75 
1,25 
2,25 
0,75 
44,0 
7 
6,25 
3,75 
2,25 
0,75 
37,7 
8 
18,75 
3,75 
2,25 
0,75 
40,6 
9 
6,25 
1,25 
0,75 
2,25 
18,2 
10 
18,75 
1,25 
0,75 
2,25 
40,8 
11 
6,25 
3,75 
0,75 
2,25 
32,5 
12 
18,75 
3,75 
0,75 
2,25 
32,6 
13 
6,25 
1,25 
2,25 
2,25 
45,4 
14 
18,75 
1,25 
2,25 
2,25 
29,3 
15 
6,25 
3,75 
2,25 
2,25 
19,1 
16 
18,75 
3,75 
2,25 
2,25 
35,0 
17 
0,0 
2,5 
1,5 
1,5 
11,7 
18 
25,00 
2,5 
1,5 
1,5 
34,8 
19 
12,5 
0,0 
1,5 
1,5 
37,9 
20 
12,5 
5,0 
1,5 
1,5 
24,1 
21 
12,5 
2,5 
0,0 
1,5 
26,3 
22 
12,5 
2,5 
3,0 
1,5 
3,2 
23 
12,5 
2,5 
1,5 
0,0 
26,9 
24 
12,5 
2,5 
1,5 
3,0 
37,0 
25 
12,5 
2,5 
1,5 
1,5 
13,3 
26 
12,5 
2,5 
1,5 
1,5 
34,5 
27 
12,5 
2,5 
1,5 
1,5 
35,6 
28 
12,5 
2,5 
1,5 
1,5 
23,1 
29 
12,5 
2,5 
1,5 
1,5 
34,7 
30 
12,5 
2,5 
1,5 
1,5 
38,2 
Onde: E.L.= extrato de levedura 
Os  resultados  obtidos  nestes  experimentos  mostram  que  as 
concentrações  dos  nutrientes  precisam  ser  alteradas  proporcionalmente,  pois, 

CAPÍTULO 5: Resultados e Discussões 
 
Danielle da Silveira dos Santos 
141     
em geral, quando ocorre um aumento excessivo de apenas um componente do 
meio,  observa-se um  decréscimo  na  produção  de  etanol.  Como  exemplo,  nos 
experimentos  21  e  22,  as  concentrações  de  etanol  foram  alteradas  de  26  g/L 
para  3  g/L  quando  (NH4)
2
SO
4
 teve  a  sua  concentração  aumentada  e  a  dos 
outros nutrientes mantiveram-se constantes, respectivamente.  
Nos experimentos 6 e 13  nota-se que maiores proporções  de MgSO
4
 e 
menores proporções de extrato de levedura resultaram em altas concentrações 
de  etanol,  uma  vez  que  os  melhores  resultados  foram  obtidos  quando  estas 
variáveis  encontravam-se  nos  seus  níveis  (+)  e  (-),  alcançando  44  e  45  g/L, 
respectivamente.  
A análise estatística de variância obtida pelo planejamento experimental, 
apresentada  na  tabela  5.13,  indica  que  o  modelo  quadrático  foi  o  mais 
adequado,  por  apresentar  maior  significância  (p<0,05)  e  maior  valor  de  R
2
 
(0,770)  para  a  produção  de  etanol.  O  Lack of  fit  mostrou-se  significativo,  pois 
apenas  o  parâmetro  A  (extrato  de  levedura)  teve  elevada  influência 
individualmente, embora as interações  duplas também tenham se apresentado 
significativas  (com  exceção  da  AD,  entre  extrato  de  levedura  e  MgSO
4
). 
Portando,  o  modelo  foi  mantido  hierárquico,  ou  seja,  completo  com  seus 
parâmetros e interações, apresentando-se significativo.  
A  equação  referente  à  concentração  de  etanol  é  apresentada  na 
equação (6). 
[Etanol]  =  +37,42+4,81  A  +  0,81B  -1,52C  +2,70D  -0,22AB-3,28AC+5,00AD 
+3,42BC-1,56BD+5,16CD -2,81A
2
-1,81B
2
- 2,19C
2
 -2 44D
2
              (6) 
Dentre  os  nutrientes  analisados  do  Planejamento  Composto  Central,  a 
variável  A  (extrato  de  levedura)  apresentou  a  maior  influência,  seguida  da 
variável  D  (MgSO4.7H
2
O),  que,  por  sua  vez  foi  superior  à  variável  C 
((NH4)
2
SO
4
)  e,  finalmente,  à  variável  B  (KH
2
PO
4
),  a  qual  apresentou  baixos 
valores  de  Soma  dos  Quadrados  (SQ).  Dentre  as  interações  duplas,  a  mais 
influente foi entre C e D ([NH
4
]
2
SO
4
), seguida da interação entre A e D (extrato 
de levedura e MgSO
4
.7H
2
O), entre B e C (KH
2
PO
4
 e (NH4)
2
SO
4
), A e C (extrato 

CAPÍTULO 5: Resultados e Discussões 
 
Danielle da Silveira dos Santos 
142     
de levedura e (NH
4
)
2
SO
4
), B e D (KH
2
PO
4
 e (NH
4
)2SO
4
) e, por fim, entre A e B 
(extrato de levedura e KH2PO
4
), apresentando-se pouco significativa.  
Tabela  5.13.  Análise  de  variância  da  produção  de  etanol,  empregando 
diferentes  concentrações  de  extrato  de  levedura,  KH
2
PO
4
,  (NH
4
)
2
SO
4
  e 
MgSO
4
.7H
2
O,  através  do  processo  SSF  por  Zymomonas  mobilis  CP4  a  partir 
de resíduo da indústria de celulose.  
 
SQ 
GL 
MQ 
F-Valor 
p-valor 
Modelo 
2452,78 
14 
175,20 
3,59 
0,0097 
A 
554,25 
1 
554,25 
11,34 
0,0042 
B 
15,71 
1 
15,71 
0,32 
0,5791 
C 
55,11 
1 
55,11 
1,13 
0,3051 
D 
175,22 
1 
175,22 
3,59 
0,0777 
AB 
0,76 
1 
0,76 
0,016 
0,9025 
AC 
171,66 
1 
171,66 
3,51 
0,0805 
AD 
399,90 
1 
399,90 
8,18 
0,0119 
BC 
186,98 
1 
186,98 
3,83 
0,0693 
BD 
39,18 
1 
39,18 
0,80 
0,3847 
CD 
426,66 
1 
426,66 
8,73 
0,0098 
A2 
216,81 
1 
216,81 
4,44 
0,0524 
B2 
90,01 
1 
90,01 
1,84 
0,1948 
C2 
131,13 
1 
131,13 
2,68 
0,1222 
D2 
162,83 
1 
162,83 
3,33 
0,0879 
Resíduo 
732,97 
15 
48,86 
 
 
Lack of Fit 
712,08 
10 
71,21 
17,04 
0,0030 
Erro Puro 
20,90 
5 
4,18 
 
 
Cor. Total 
3185,75 
29 
 
 
 
SQ= Soma dos Quadrados; GL= Grau de Liberdade; MQ= Média Quadrática 
A: Extrato de levedura; B: KH
2
PO
4
; C: (NH
4
)
2
 SO
4
; D: MgSO
4
.7H
2
O. 
 
De acordo com a análise de superfície de resposta, na figura 5.16 (A) é 
possível  observar  as  interações  entre  extrato  de  levedura  e  MgSO4.7H2O 
(mantendo (NH4)
2
SO
4
 e KH
2
PO
4
 em seus pontos centrais), constatando que a 
maior produção de etanol ocorre quando AD estão em seus níveis máximos, o 
que aponta para a ampliação das faixas de estudo deste planejamento. A figura 
5.16 (B) indica para a redução das concentrações de  KH
2
PO
4
 e de (NH4)
2
SO
4
 
(g/L);  assim  como  a  figura  5.16  (C)  avalia  as  interações  entre  (NH
4
)
2
SO
4
  e
 
MgSO
4
.7H
2
O
 
e  indica  que  a  maior  produção  de  etanol  ocorre  na  faixa  dos 
pontos centrais.   

CAPÍTULO 5: Resultados e Discussões 
 
Danielle da Silveira dos Santos 
143     
 
Figura 5.16. Superfícies de resposta mostrando efeitos de extrato de levedura 
e MgSO
4
.7H
2
O
 
(A);
 
KH
2
PO
4
 e (NH4)
2
SO
4
 (B); (NH
4
)
2
SO
4
 e
 
MgSO
4
.7H
2
O
 
(C) e 
suas interações na produção de etanol através do processo SSF por Z. mobilis 
CP4 a partir de resíduo da indústria de celulose. 
 

CAPÍTULO 5: Resultados e Discussões 
 
Danielle da Silveira dos Santos 
144     
As  condições  ótimas  obtidas  para  a  produção  de  etanol  através  do 
processo  SSF  a  partir  de  PM2  foram:  extrato  de  levedura  (6,25  g/L),  KH
2
PO
4
 
(1,25  g/L),  (NH
4
)
2
SO
4 
(2,25  g/L)  e  MgSO
4
  (2,25  g/L),  resultando  na  máxima 
concentração  de  etanol  (54  g/L),  a  partir  de  91  g/L  de  glicose  inicial  do 
processo, após pré-hidrólise enzimática de 12 horas, na temperatura de  50ºC, 
relação sólido:líquido de 2:10 g/mL e carga enzimática de 17,5 FPU/g; seguida 
de  posterior  adição  de  1,59%  (v/v)  de  células  (após  20  h  de  crescimento 
celular),  na  temperatura  de  30ºC,  150  rpm  de  agitação  e  pH  5,  em  biorreator 
instrumentado (Figura 5.17).  
 
Figura 5.17.
 
Perfil cinético da melhor condição obtida (extrato de levedura, 6,25 
g/L;  KH
2
PO
4
,  1,25  g/L;  (NH
4
)
2
SO
4
,  2,25  g/L  e  MgSO
4
,  2,25  g/L)  para  a 
produção  de  etanol  através  do  processo  SSF  por  Z.  mobilis  CP4  a  partir  de 
resíduo  da  indústria  de  celulose,  em  biorreator  instrumentado.  P.H.=  pré-
hidrólise enzimática, SSF: fermentação e sacarificação simultâneas. 
Neste  contexto,  conclui-se  que  a  presença  de  todos  os  nutrientes 
analisados (extrato de levedura, (NH
4
)
2
SO
4
, KH
2
PO
4 
e MgSO
4
) são de extrema 
importância  para  o  crescimento  bacteriano  nestes  experimentos,  assim  como 
para a produção de etanol. Nota-se que a produção de etanol a partir de PM2 
foi  inferior  à  alcançada  por  Silva  et  al.  (2009),  de  aproximadamente  78  g/L, 
SSF 
P.H. 

CAPÍTULO 5: Resultados e Discussões 
 
Danielle da Silveira dos Santos 
145     
contudo, estes autores reportaram o valor de produtividade volumétrica de 1,23 
g/L.h, ao passo este parâmetro foi de 3,6 g/L.h no presente trabalho. 
5.1.4.  Análise Comparativa 
Os  resultados  deste  trabalho  foram  superiores  aos  alcançados  por 
diversos  autores  que  empregaram  a  levedura  Saccharomyces  cerevisiae  no 
que  tange  à  produção  de  etanol  através  do processo  SSF.  Kang  et  al. (2010) 
utilizaram lama de cal proveniente da indústria de celulose como matéria-prima, 
tendo sido atingido 45 g/L de etanol após 150 h. Já Ruiz et al. (2010) utilizaram 
madeira de oliva e caule de girassol, alcançando apenas 29,4 g/L e 20,9 g/L de 
etanol,  respectivamente,  após  72  h.  Linde  et  al.  (2006)  reportaram  a 
concentração de 25 g/L de etanol após 120 h de processo realizado com palha 
de cevada. E, Martin et al. (2002) obtiveram apenas 12 g/L de etanol a partir de 
bagaço  de  cana,  após  48 h;  enquanto  Zhu  et  al.  (2010)  atingiram  41,8  g/L  de 
etanol a partir de cavaco de pinus. 
  
A  tabela  5.14  compara  os  resultados  obtidos  no  presente  trabalho  com 
outros  reportados  na  literatura  empregando  linhagens  nativas  da  bactéria 
Zymomonas  mobilis,  em  termos  de  produtividade  e  produção  de  etanol  2G, 
para o processo utilizando materiais de composição lignocelulósica.  
Tabela 5.14. Principais resultados relatados na literatura para o processo a partir 
de matéria-prima lignocelulósica com linhagens nativas de Z. mobilis. 
 Onde:  MP:  matéria-prima;  S:  substrato;  P:  produto;  Q
p
:  produtividade 
volumétrica;  gli:  glicose;  sig:  sigmacell;  ART:  acúcares  redutores  totais;  SR: 
sistema  reacional;  FA:  frascos  agitados;  BR:  biorreator.  Referência  Bibliográfica: 
1.  Golias  et  al.  (2002);  2.  Eklund  &  Zachi  (1995);  3.  Ma  et  al.  (2009);  4.  este 
trabalho. 
MP/Meio 
S (g/L) 
X
o
 
SR 
P (g/L) 
Q
p 
(g/L.h)  Ref. 
Sigmacell 
100 sig 
0,3 g/L 
FA 
36 
0,3 
1 
Salgueiro 
61 gli 
3 g/L 
FA e BR 
29 
0,6 
2 
Lixo de Cozinha 
70 ART 
10% (v/v) 
FA 
52 
1,44 
3 
Bagaço de cana 
80 gli 
4 g/L 
FA e BR 
60 
1,66 
4 

CAPÍTULO 5: Resultados e Discussões 
 
Danielle da Silveira dos Santos 
146     
No  experimento  realizado  por  Golias  et  al.  (2002),  em  que  foi  utilizada 
uma associação de Z. mobilis com K. oxytoca P2 termotolerante, foi obtida uma 
concentração  de  etanol  de  36  g/L,  em  120  horas  de  processo,  possivelmente 
porque  a  cargas  enzimática  e  as  concentrações  celulares  foram  baixas  (15 
FPU/g e 0.320  g/L, respectivamente), além da temperatura de 35°C não ser  a 
ideal para linhagens da bactéria Z. mobilis, o que pode ter causado lentidão no 
processo, conforme sinalizado anteriormente. Os autores também analisaram o 
desempenho de Saccharomyces pastorianus e de Z. mobilis separadamente, e 
o resultado de produção de etanol foi semelhante, em torno de 37 g/L e 40 g/L 
respectivamente. 
 
O  trabalho  de  Eklund  &  Zachi
 
(1995)  foi o  mais  semelhante  ao  presente 
estudo  em  relação  às  condições  operacionais  do  processo  fermentativo,  pois 
foi  utilizado  um  resíduo  lignocelulósico  (Salgueiro,  espécie  Salix  caprea), 
empregando  Z.  mobilis  sem  a  associação  com  outros  microrganismos.  Os 
autores visaram otimizar o processo através de um planejamento experimental, 
no  qual  as  melhores  condições  alcançadas  foram  as  seguintes:  carga 
enzimática (18 FPU/g), concentração celular (3 g/L) e nutrientes adicionais ao 
meio, extrato de levedura (2,5 g/L), (NH
4
)
2
HPO
4
 (0,25 g/L), MgSO
4
.7H
2
0 (0,025 
g/L) e 0,1 M de tampão fosfato (pH 5). 
 
Ainda segundo Eklund & Zachi
 
(1995), foram feitas comparações entre o 
processo SSF e SHF, e, embora os autores tenham alcançado concentrações 
de  etanol  de  29  g/L,  em  48  horas  de  fermentação,  o  processo  SSF  reduziu a 
formação de subprodutos em relação ao processo SHF. Além deste estudo, foi 
feita  uma  comparação  entre  o  desempenho  da  bactéria  Zymomonas  mobilis 
com  a  levedura  Saccharomyces  cerevisae,  apresentando  resultados 
semelhantes  nas  mesmas  condições  operacionais.  Adicionalmente,  estes 
autores verificaram que um aumento na concentração celular da levedura de 4 
para 10 g/L resultava em um acréscimo na  produção de etanol de 29 para a 39 
g/L.  Contudo,  o  mesmo  não  foi  observado  quando  a  bactéria  Z.  mobilis  foi 
utilizada,  uma  vez  que  o  aumento  na  concentração  celular  para  10  g/L  não 
apresentou  influência  significativa  na  concentração  final  de  etanol,  a  qual 
manteve-se  em  torno  de  29  g/L.  Cabe    ressaltar  que  a  temperatura  de  37°C 

CAPÍTULO 5: Resultados e Discussões 
 
Danielle da Silveira dos Santos 
147     
pode ter promovido uma redução na produção de etanol, uma vez que 30°C é a 
temperatura ideal ótima para o metabolismo de Zymomonas mobilis. De forma 
semelhante,  no  presente  trabalho, quando  concentrações  elevadas  de  células 
eram  empregadas  na  fermentação  por  PM2,  os  resultados  de  produção  de 
etanol alcançados também se mostraram reduzidos.  
Ma et al. (2009) empregaram  lixo de cozinha, que continha resíduos de 
celulose, amido, gordura, proteína e glicose, e, empregando a estratégia  SSF, 
atingiram  resultados  semelhantes  aos  obtidos  no  presente  estudo  (Tabela 
5.10).  Os  autores  também  avaliaram  a  utilização  de  uma  linhagem  ácido-
tolerante  (Z.  mobilis  GZNS1),  sob  condições  estéreis  e  não  estéreis, 
apresentando  resultados  semelhantes  aos  obtidos  com  a  linhagem  selvagem, 
atingindo-se concentrações de etanol de 48 g/L e 46 g/L, respectivamente, em 
36 h de processo, na temperatura de 30°C.  
O  bagaço  de  cana  de  açúcar  pré-tratado  e  o  resíduo  da  indústria  de 
celulose  (PM2)  apresentaram  grande  potencial  para  a  produção  de  etanol  de 
segunda geração por Z. mobilis, obtendo a maior produção de etanol em 65 g/L 
e  58  g/L;  assim  como  2,70  e  3,6  g/L.h  de  produtividade  volumétrica, 
respectivamente (Tabela 5.15).     
Tabela  5.15.  Resultados  obtidos  pela linhagem  nativa  de  Zymomonas  mobilis 
CP4 a partir do processo SSF e a partir da fermentação em meio sintético.  
Experimentos 
Condições 
Valores máximos 
S
o
 (g/L) 
t
f 
 (h) 
X
o
  
P (g/L) 
Q
P 
(g/L.h) 
Ensaios prévios 
Meio sintético 
17 
19 
10% (v/v) 
6,3 
0,33 
Bagaço de cana-de-açúcar 
1 
80,3 
40 
4 g/L 
60,7 
1,52 
2 
85 
24 
4 g/L 
65 
2,70 
Resíduo da indústria de celulose 
3 
82 
21 
1,59% (v/v) 
58 
2,76 
4 
91 
15 
1,59% (v/v) 
54 
3,6 
Onde:
 
S
0
:  concentração  inicial  de  glicose,  t
f 
(h):  tempo  de  fermentação,  X
0
: 
concentração inicial de células, P: concentração final de etanol, Qp: produtividade 
volumétrica. 1 e 3: avaliação da concentração inicial de células, carga enzimática 
e relação sólido:líquido (g:mL) no processo a partir do bagaço  de cana e de PM2, 
respectivamente;  2  e  4:  avaliação  da  adição  de  extrato  de  levedura,  KH
2
PO
4
, 
(NH
4
)
2
SO
4
  e  MgSO
4
  no  meio  pré-hidrolisado  a  partir  do  bagaço  de  cana  e  de 
PM2, respectivamente.  

CAPÍTULO 5: Resultados e Discussões 
 
Danielle da Silveira dos Santos 
148     
Analisando-se  comparativamente  os  resultados  do  presente  trabalho  no 
que  tange  ao  processo  SSF  empregando  o  microrganismo  Z.  mobilis 
naturalmente  ocorrente,  após  o  pré-tratamento  enzimático  de  12  horas,  as 
concentrações iniciais de glicose a partir do bagaço de cana foram inferiores às 
alcançadas  a  partir  de  PM2,  obtendo-se  85  e  91  g/L  deste  açúcar, 
respectivamente, embora as concentrações de etanol tenham sido ligeiramente 
superiores  às  atingidas  a  partir  do  resíduo  de  celulose.  O  fato  do  PM2  ter 
apresentado  valores  superiores  de  glicose  inicial  pode  ter  sido  o  motivo  pelo 
qual  a  produtividade  volumétrica  foi  superior  à  obtida  a  partir  do  bagaço,  em 
torno de 3,6  g/L.h e 2,7 g/L.h, respectivamente.  
Os níveis de celobiose permaneceram praticamente inalterados ao longo 
do processo SSF empregando resíduos da indústria de celulose, ao passo que 
utilizando  o  bagaço  de  cana, tais  níveis  apresentaram  uma  pequena  redução, 
mostrando que a enzima 

-glucosidase manteve boa atividade, uma vez que as 
concentrações de celobiose encontraram-se próximas de zero ao final do SSF. 
A  glicose  foi  consumida  de  forma  integral  ao  final  do  processo,  o  que  mostra 
que este açúcar foi facilmente fermentado pela bactéria.  
Através  dos  resultados  obtidos  no  presente  estudo  e  dos  experimentos 
reportados  na  literatura  conclui-se  que  Z.  mobilis  tem  o  potencial  de 
revolucionar a indústria de etanol combustível comercialmente no que tange ao 
aproveitamento  da  fração  celulósica,  não  só  em  escala  laboratorial,  mas 
também  piloto  e industrial,  pois a  bactéria  pode  gerar  um  rendimento  próximo 
ao  máximo  teórico  a  partir  de  várias  matérias-primas,  incluindo  a  cana-de-
açúcar  (RODRIGUEZ  et  al.,  1986),  mandioca;  sagu  (LEE  et  al.,  1986)  e 
hidrolisados  enzimáticos  de  derivados  de  celulose  de  madeira  (PARK  et  al., 
1993;  PAREKH  et  al.,  1989).  No  entanto,  uma  limitação  ao  potencial  da 
bactéria Z. mobilis naturalmente ocorrente para a produção industrial de etanol 
é a sua capacidade de utilizar apenas glicose, frutose ou sacarose como fonte 
de  energia,  como  descrito  no  capítulo  de  Revisão  Bibliográfica,  além  de  não 
fermentar  a  xilose  (açúcar  abundante  na  fração  hemicelulósica  do  bagaço  de 
cana),  conforme  observado  no  item  5.1.1,  a  menos  que  seja  geneticamente 
modificada (LAWFORD et al., 1997 e YANASE et al., 2005). 

CAPÍTULO 5: Resultados e Discussões 
 
Danielle da Silveira dos Santos 
149