Ocorrente e recombinante, empregando

Tabela  5.22.  Processo  de  adaptação  metabólica  mediante  25  ciclos 
fermentativos,  variando  as  concentrações  de  hidrolisado  ácido  proveniente  do 
bagaço  de  cana  e  mantendo  a  concentração  de  glicose  em  20  g/L,  após  o  26
o
 
ciclo de adaptação metabólica em meio sintético.   
 Onde: H.H.=hidrolisado hemicelulósico; A.A.= Ácido acético. 
Adicionalmente, a tabela 5.23 indica as variáveis de resposta calculadas 
comparando-se  os  primeiros  e  os  últimos  ciclos,  indicando  que  a  técnica  de 
adaptação metabólica tende a promover melhores resultados de crescimento e 
produção  de  etanol  (5,2  g/L  a  5,9  g/L),  variando  de  diferentes  proporções  de 
hidrolisado  hemicelulósico,  de  2,5  a  20%  v/v,  respectivamente;  contudo,  a 
produtividade volumétrica foi inferior, variando de 0,074 g/L.h e 0,0614 g/L.h.  
 
Ciclos 
Tempo  
(Dias) 
H.H.  
(%) v/v 
A.A.  
(g/L) 
HMF 
(mg/L) 
Furfural 
(mg/L) 
Etanol 
(g/L) 
Biomassa 
(g/L) 
1-5 
14 
2,5 
0,28 
1,3 
13,2 
5,2 
0,086 
6-10 
20 
5 
0,53 
16,0 
27,6 
4,8 
0,137 
11-15 
25 
10 
0,92 
9,4 
54,1 
5,3 
0,139 
16-20 
20 
15 
1,2 
13,2 
83,3 
4,7 
0,107 
21-25 
20 
20 
2,1 
15,6 
108,7 
5,9 
0,117 

CAPÍTULO 5: Resultados e Discussões 
 
Danielle da Silveira dos Santos 
160     
Tabela 5.23. Comparação das variáveis medidas e calculadas entre diferentes 
etapas de adaptação metabólica. 
Variáveis medidas e calculadas 
Ciclo 1-5  Ciclo 20-25 
Etanol (g/L)* 
5,2 
5,9 
Células (g/L)* 
0,086 
0,117 
Produtividade (g/L.h)* 
0,074 
0,061 
*Ao final do último ciclo 
 
 
   
Observa-se  que  alguns  fatores,  como  a  inibição  por  compostos 
presentes  no  hidrolisado  e  o  tempo  de  crescimento  foram  superados;  não 
obstante,  são  necessárias  melhorias  na  fermentação  a  partir  do  hidrolisado 
ácido, através da continuação dos ciclos adaptativos, visando elevar os níveis 
de  tolerância  dos  inibidores,  assim  como  os  valores  de  produtividade 
volumétrica. 
II.  Processo  de  propagação  mediante  diferentes  estratégias  de 
aclimatação celular 
  Segundo  Betancur  et  al.  (2010),  os  microrganismos  consomem  o 
substrato  de  forma  mais  eficiente  quanto  maior  o  grau  de  aclimatação,  a 
exemplo de processos de fermentação por Pichia stipitis a partir de hidrolisado 
hemicelulósico.  Portanto,  mesmo  que  as  células  estejam  previamente 
adaptadas  com  a  presença  de  inibidores,  faz-se  necessária  a  aclimatação 
anteriormente  ao  inóculo.  No  presente  trabalho,  foram  desenvolvidas  4 
diferentes  estratégias,  conforme  descrito  no  item  4.4.2.2  (Capítulo  4),  cujos 
resultados são apresentados na tabela 5.24.  
Tabela 5.24. Crescimento celular em diferentes estratégias de aclimatação. 
Estratégias 
Tempo*  
(Dias) 
H.H.*  
% (v/v) 
A.A.*  
(mg/L) 
HMF* 
(g/L) 
Furfural* 
(mg/L) 
Biomassa* 
(g/L) 
A 
5 
10 
0,85 
7,0 
52,7 
0,058 
B 
3 
10 
0,91 
9,6 
47,2 
0,145 
C 
2 
20 
1,88 
17,8 
97,1 
0,109 
D 
2 
20 
1,96 
20,4 
101,3 
0,129 
E 
2 
20 
2,06 
17,5 
105,6 
0,115 
Onde:  H.H.=  hidrolisado  hemicelulósico;  A.A.=  ácido  acético;  A=sem  aclimatação; 
B=aclimatação  de  5%  a  10%  v/v  de  H.H.;  C=  aclimatação  de  5%  a  20%v/v  de  H.H.; 
D=aclimatação  inicial  de  H.H.,  5%  v/v,  seguida  da  propagação  em  H.H.,  10%  v/v  e 
posterior centrifugação; E=aclimatação inicial de H.H., 5% v/v, seguida da propagação em 
H.H.,  20%  v/v,  e  posterior  centrifugação.  *Valores  referentes  à  última  etapa  de 
propagação.     
O processo de aclimatação empregando de 5% a 10% v/v de hidrolisado 
hemicelulósico  adicionado  do  meio  RMG
 
apresentou  o  melhor  resultado,  com 

CAPÍTULO 5: Resultados e Discussões 
 
Danielle da Silveira dos Santos 
161     
uma  concentração  celular  de  0,09  g/L,  superior  aos  valores  encontrados  para 
uma  única  etapa  de  aclimatação  celular  (0,03  g/L)  ou  mesmo  através  de 
centrifugação empregando de 5% a 10% v/v de hidrolisado (D), assim como de 
5%  a  20%  v/v  de  hidrolisado  (D),  promovendo  0,08  e  0,07  g/L.  Dessa  forma, 
pode-se  concluir  que  a  inclusão  de  duas  etapas  de  aclimatação,  de  5%  v/v  a 
10% v/v de hidrolisado hemicelulósico (B), apresentaram efeito positivo sobre a 
produção  de  biomassa,  sendo  a  condição  escolhida  para  propagação  celular 
nos experimentos futuros. 
III.  Avaliação da produção de etanol a partir do processo SSCF através 
de planejamentos experimentais sequenciais 
Foram  desenvolvidos  dois  Planejamentos  Sequenciais  de  Superfície  de 
Resposta  2
2
,  avaliando  a  concentração  de  sólidos  do  bagaço  de  cana  pré-
tratado  (g:mL),  assim  como  a  proporção  de  hidrolisado  hemicelulósico  no 
processo SSCF, atingindo a maior produção de etanol em 25,04 g/L, a partir de 
2,21:10  g:mL  e  20%  v/v,  respectivamente,  no  primeiro  Planejamento  (Tabela 
5.25).  
Tabela  5.25.  Primeiro  Planejamento  2
2 
avaliando  o  percentual  de  hidrolisado 
hemicelulósico (%), bem como a relação sólido:líquido (g:mL) do bagaço de cana-
de-açúcar  pré-tratado  através  do  processo  SSCF  1  para  a  produção  de  etanol 
pela  linhagem  recombinante  de  Zymomonas  mobilis  CP4,  após  o  25
o
  ciclo  de 
adaptação metabólica em meio sintético.  
 
Ex. 
Variáveis independentes 
Condições 
Resposta 
H. H. (%)  
S:L (g:mL) 
Glicose inicial(g/L)  Xilose inicial(g/L)  Etanol (g/L) 
1 
45,00 
2,21:10  
67,3 
24,5 
7,5 
2 
20,00 
2,0: 10 
57,4 
9,6 
25,0 
3 
80,36 
1,5: 10 
38,9 
61,1 
0,0 
4 
70,00 
2,0: 10 
61,4 
53,6 
0,0 
5 
9,64 
1,5: 10 
36,5 
5,3 
7,4 
6 
45,00 
1,5: 10 
33,8 
27,9 
11,0 
7 
45,00 
1,5: 10 
39,2 
30,1 
2,2 
8 
45,00 
1,5: 10 
36,1 
32,0 
2,2 
9 
70,00 
1,0: 10 
25,0 
51,7 
1,5 
10 
45,00 
1,5: 10 
34,6 
33,3 
4,3 
11 
20,00 
1,0: 10 
23,3 
10,1 
7,6 
12 
45,00 
0,79: 10 
14,9 
40,5 
3,3 
13 
45,00 
1,5: 10 
37,5 
35,0 
4,0 
Onde: H. H= hidrolisado hemicelulósico; S:L= relação sólido:líquido. 
 
Cabe ressaltar que no experimento  6 houve a segunda maior produção 
de etanol, em 10 g/L, sob a presença do hidrolisado hemicelulósico (variável A) 

CAPÍTULO 5: Resultados e Discussões 
 
Danielle da Silveira dos Santos 
162     
em  seu  nível  médio.  Todavia,  nota-se  que  os  outros  experimentos  que 
possuíam  proporções  deste  licor  acima  de  45%  v/v  apresentaram  baixa 
produção de etanol,  o que nos remete a uma inibição pela presença de HMF, 
furfural e ácido acético.  
Posteriormente,  foi  desenvolvido  outro  Planejamento  Experimental 
avaliando  os  mesmos  parâmetros,  porém  em  proporções  inferiores  para  a 
variável  A  (hidrolisado)  e  superiores  para  a  variável  B  (relação  sólido:líquido). 
Observa-se, na tabela 5.26, que a maior concentração de etanol alcançada foi 
de 27,32 g/L, nas seguintes condições: 2,99:10 de bagaço de cana pré-tratado 
(g:mL),  assim  como  a  proporção  de  hidrolisado  hemicelulósico  de  20%  v/v. 
Quando  a  concentração  de  sólidos  mantinha-se  baixa,  associadamente  ao 
percentual  de  hidrolisado  ácido,  as  concentrações  de  etanol  eram  reduzidas, 
como  exemplo  do  experimento  10,  contudo,  nas  condições  contrárias 
(experimento 6) foram alcançados 24 g/L.   
Tabela  5.26.  Segundo  Planejamento  2
2 
avaliando  o  percentual  de  hidrolisado 
hemicelulósico (%), bem como a relação sólido:líquido (g:mL) do bagaço de cana-
de-açúcar pré-tratado através do processo SSCF 2 para a produção de etanol pela 
linhagem recombinante de Zymomonas mobilis CP4, após o 25
o
 ciclo de adaptação 
metabólica em meio sintético. 
 
Ex. 
Variáveis independentes 
Condições 
Resposta 
H. H. (%)  
S:L (g:mL) 
Glicose inicial (g/L)  Xilose inicial (g/L) 
Etanol (g/L) 
1 
20,50 
2,0:10 
59,3 
12,5 
18,2 
2 
6,50 
1,3:10 
34,0 
5,1 
1,6 
3 
20,50 
2,99:10 
48,9 
11,0 
27,3 
4 
34,50 
1,3:10 
36,1 
18,7 
5,1 
5 
20,50 
2,0:10 
57,8 
14,2 
15,2 
6 
0,70 
2,0:10 
62,6 
0,6 
24,0 
7 
40,30 
2,0:10 
65,2 
23,4 
5,70 
8 
20,50 
2,0:10 
63,7 
8,0 
15,6 
9 
6,50 
2,7:10 
51,3 
3,9 
23,3 
10 
20,50 
1,0:10 
23,5 
7,7 
4,5 
11 
34,50 
2,7:10 
73,0 
21,3 
5,2 
12 
20,50 
2,0:10 
62,1 
8,2 
17,0 
13 
20,50 
2,0:10 
60,4 
12,6 
8,8 
Onde: H. H= hidrolisado hemicelulósico; S:L= relação sólido:líquido. 
De  acordo  com  a  análise  de  variância  do  Planejamento  SSCF  1  e  do 
Planejamento SSCF 2 (Tabelas 5.27 e 5.28) nota-se que o modelo linear (2FI: 
two-factor interactions) e o modelo quadrático, respectivamente, apresentaram 
um  ajuste  adequado  aos  resultados  experimentais,  com  um  coeficiente  de 

CAPÍTULO 5: Resultados e Discussões 
 
Danielle da Silveira dos Santos 
163     
correlação R
2
 de 0,7 e 0,8; sendo o erro puro e a falta de ajuste insignificantes 
para o intervalo de confiança de 90%.  
Tabela  5.27.    Análise  de  Variância  da  concentração  de  etanol  alcançada  no 
primeiro  Planejamento  Experimental  do  processo  SSCF1  a  partir  do  bagaço-
de-cana por Z. mobilis recombinante.  
 
SQ 
GL 
MQ 
F-Valor 
p-valor 
Modelo 
366,91 
3 
122,30 
6,76 
0,0111 
A 
217,04 
1 
217,04 
12,00 
0,0071 
B 
60,22 
1 
60,22 
3,33 
0,1013 
AB 
89,66 
1 
89,66 
4,96 
0,0530 
Resíduo 
162,73 
9 
18,08 
 
 
Lack of Fit 
109,96 
5 
21,99 
1,67 
0,3204 
Erro Puro 
52,77 
4 
13,19 
 
 
Cor. Total 
529,64 
12 
 
 
 
 
 
Tabela  5.28.    Análise  de  Variância  da  concentração  de  etanol  alcançada  no 
segundo  Planejamento  Experimental  do  processo  SSCF2  a  partir  do  bagaço-
de-cana por Z. mobilis recombinante. 
 
SQ 
GL 
MQ 
F-Valor 
p-valor 
Modelo 
700,29 
5 
140,06 
5,71 
0,0205 
A 
201,31 
1 
201,31 
8,20 
0,0242 
B 
360,93 
1 
360,93 
14,71 
0,0064 
AB 
114,43 
1 
114,43 
4,66 
0,0677 
A
2
 
18,21 
1 
18,21 
0,74 
0,4175 
B
2
 
8,19 
1 
8,19 
0,33 
0,5817 
Resíduo 
171,80 
7 
24,54 
 
 
Lack of Fit 
120,36 
3 
40,12 
3,12 
0,1502 
Erro Puro 
51,43 
4 
12,86 
 
 
Cor. Total 
872,08 
12 
 
 
 
Onde:  A=  hidrolisado  hemicelulósico,  B=  relação  sólido:líquido;  SQ= 
Soma dos Quadrados; GL= Grau de Liberdade; MQ= Média Quadrática. 
Os  modelos  do  processo  SSCF1  e  SSCF2  são  representados  pelas 
equações (8) e (9), respectivamente: 
[Etanol]: +5,84 - 5,21A + 2,74B - 4,73AB 
 
                                 (8) 
[Etanol]: +14,96 - 5,06A + 6,75B- 1,70A
2
 
–
 1,17 B
2
 
–
 5,42 AB                     (9)  
Os modelos foram significativos, sendo que para o SSCF 1, o parâmetro 
A  (hidrolisado  hemicelulósico)  apresentou  maior  influência  na  concentração 
final  de  etanol,  seguido  da  interação  AB  e  do  parâmetro  B  (relação 

CAPÍTULO 5: Resultados e Discussões 
 
Danielle da Silveira dos Santos 
164     
sólido:líquido). Segundo o modelo referente ao SSCF 2, o parâmetro B (relação 
sólido:líquido)  foi  o  mais  influente,  seguido  do  parâmetro  A  (hidrolisado 
hemicelulósico);  somado  a  isso,  as  combinações  que  apresentaram  maior 
influência foram entre AB, seguido de A
2
 e B
2
. 
Adicionalmente, a figura 5.22 mostra a superfície de contorno, avaliando 
o  percentual  de  hidrolisado  hemicelulósico  (%),  bem  como  a  relação 
sólido:líquido  (g:mL)  do  bagaço  de  cana-de-açúcar  pré-tratado  através  do 
processo  SSCF  1,  no  que  tange  à  produção  de  etanol  pela  linhagem 
recombinante  de  Zymomonas  mobilis  CP4.  Observa-se  que  o  gráfico  aponta 
para a redução do parâmetro A (hidrolisado hemicelulósico) e  ao aumento das 
concentrações  do  parâmetro  B  (relação  sólido:líquido),  sendo  necessária  a 
execução de outro planejamento para que os experimentos sejam otimizados. 
 
 Figura  5.22.  Superfície  de  contorno  avaliando  efeitos  combinados  entre  os 
parâmetros  sobre  a  produção  de  etanol  a  partir  do  primeiro  Planejamento 
Experimental  referente  ao  processo  SSCF  1  pela  linhagem  recombinante  de 
Zymomonas mobilis.  

CAPÍTULO 5: Resultados e Discussões 
 
Danielle da Silveira dos Santos 
165     
Desta  forma,  após  execução  do  segundo  Planejamento,  a  figura  5.23 
mostra a superfície de contorno avaliando o hidrolisado hemicelulósico (%) v/v, 
bem como a relação sólido:líquido (g:mL); os mesmos parâmetros utilizados no 
Planejamento  anterior,  embora  em  maiores  concentrações  de  sólidos  e 
menores  proporções  de  hidrolisado  ácido.  Segundo  o  gráfico  de  contorno,  a 
região  ótima  (em  vermelho)  foi  alcançada  através  destes  experimentos, 
alcançando a maior produção de etanol em  cerca de 25 g/L, valor próximo ao 
máximo atingido experimentalmente, que ocorreu em 27 g/L. 
 
 
Figura  5.23.  Superfície  de  contorno  avaliando  efeitos  combinados  entre  os 
parâmetros  sobre  a  produção  de  etanol  a  partir  do  segundo  Planejamento 
referente ao processo SSCF 2 pela linhagem recombinante de Z. mobilis. 
A reprodução da condição ótima do segundo Planejamento referente ao 
processo  de  hidrólise  enzimática  e  co-fermentação  simultâneas  por 
Zymomonas  mobilis  recombinante  ocorreu  em  biorreator  instrumento,  na 
temperatura  de  30ºC,  150  rpm  de  agitação,  pH  5,  durante  52  horas  totais; 
resultando  na  máxima  concentração  de  etanol  em  25,3  g/L  e  produtividade 
volumétrica de 0,63 g/L.h, a partir de 20,5% (v/v) de hidrolisado hemicelulósico 

CAPÍTULO 5: Resultados e Discussões 
 
Danielle da Silveira dos Santos 
166     
e  2,99:10  (g:mL)  da  relação  sólido:líquido  do  bagaço  de  cana  de  açúcar  pré-
tratado (Figura 5.24). Constatou-se que a glicose foi inicialmente metabolizada, 
seguida da xilose, a qual foi consumida em  cerca de 50%, havendo desvio da 
via  metabólica  para  a  produção  de  xilitol.  Viitanem  et  al.  (2008)  também 
relataram  sobre  a  problemática  da  formação  deste  subproduto,  assim  como  à 
lentidão  do  processo  SSCF,  constatando  que  30  g/L  desta  pentose  foi 
consumida  durante  o  período  de  50  h.  Conforme  detalhado  na  Revisão 
Bibliográfica,  o  xilitol  é  produzido  através  de  aldose  redutases  inespecíficas, 
presente  no  citoplasma  de  Zymomonas  mobilis,  entretanto  pouco  se  sabe  as 
causas  do  desvio  da  via  metabólica.  Já  segundo  Zhang  &  Chen  (2009),  a 
enzima  periplasmática  GFOR,  responsável  pela  produção  de  sorbitol,  catalisa 
também tal reação juntamente com o cofator NADPH.
 
 
Figura 5.24. Processo SSCF 2  a partir de bagaço de cana pré-tratado por Z. 
mobilis  geneticamente  modificada  em  biorreator  instrumentado,  empregando 
20,5%  (v/v)  de  hidrolisado  hemicelulósico  e  2,99:10  (g:mL)  de  relação 
sólido:líquido.  P.H.=  pré-hidrólise  enzimática,  SSCF:  co-fermentação  e 
sacarificação simultâneas. 
P.H. 
SSCF 

CAPÍTULO 5: Resultados e Discussões 
 
Danielle da Silveira dos Santos 
167     
A  tabela  5.29  representa  a  evolução  dos  ensaios  de  fermentação 
empregando  a  linhagem  recombinante  através  de  planejamentos  sequenciais. 
Inicialmente, em meio sintético, a produção de etanol foi 7,5 g/L e produtividade 
volumétrica  correspondente  de  0,180  g/L.h.  Nos  planejamentos  sequenciais 
avaliando  o  processo  SSCF  foram  produzidos  25  g/L  e  0,347  g/L.h  (primeiro 
planejamento),  assim  como  27  g/L  e  0,683  g/L.h  (segundo  planejamento)  de 
produção de etanol e produtividade volumétrica, respectivamente.  
Tabela  5.29.  Evolução  dos  resultados  obtidos  pela linhagem  recombinante  de 
Z.mobilis a partir da fermentação em  meio sintético e do processo SSCF com 
bagaço de cana pré-tratado.  
Experimentos 
Condições 
 
Valores máximos 
S
o
 (g/L) 
t
f 
 (h) 
X
o 
(%) v/v 
P (g/L) 
Q
P 
(g/L.h) 
Ensaios prévios 
1.  RMGX 
20 g/L gli 
20 g/L xil 
70 
10 
7,5 
0,107 
Bagaço de cana-de-açúcar 
2.  SSCF 1 
57 g/L gli 
9 g/L xil 
72 
10 
25 
0,347 
3.  SSCF 2 
22 g/L gli 
6,4 g/L xil 
40 
10 
27 
0,683 
Onde:
 
S
0
:  concentração  inicial  de  glicose;  t
f 
(h):  tempo  de  fermentação;  X
o
: 
concentração  inicial  de  células;  P:  concentração  final  de  etanol;  Qp:  produtividade 
volumétrica; RMG: Meio contendo glicose (20 g/L), xilose (20 g/L), extrato de levedura 
(10  g/L),  KH
2
PO
4
  (2  g/L)  e  tetraciclina  (10  mg/L);    SSCF:  hidrólise  enzimática  e  co-
fermentação simultâneas; xil: xilose inicial; gli: glicose inicial. 1. Avaliação do consumo 
de glicose e xilose em meio sintético por  Z. mobilis geneticamente modificada;  2 e 3. 
Avaliação da produção de etanol a partir do processo SSCF através de planejamentos 
experimentais sequenciais. 
Apesar  dos  resultados  não  se  mostrarem  tão  promissores  quanto  os 
alcançados  através  da  fermentação  da  glicose  oriunda  da  fração  celulósica 
pelas linhagens naturalmente ocorrentes, atingindo 65 g/L de etanol, a bactéria 
recombinante  apresenta  melhores  resultados  na  medida  em  que  os  ciclos  de 
adaptação metabólica são efetuados. Cabe ressaltar que, conforme descrito na 
Revisão  Bibliográfica,  outros  pesquisadores  também  constataram  dificuldades 
na  fermentação  a  partir  de  pentoses,  gerando  xilose  residual  e  baixas 
concentrações  de  etanol,  conforme  descrito  por  Davis  et  al.  (2005),  que 
atingiram  11  g/L  deste  biocombustível,  frente  à  6  g/L  de  glicose  e  16  g/L  de 
xilose,  e  posterior  adição  de  10  g/L  de  glicose,  gerando  12  g/L  de  xilose 
residual, durante 11 horas de processo. 

CAPÍTULO 5: Resultados e Discussões 
 
Danielle da Silveira dos Santos 
168     
Segundo  Kim  et  al.  (2000),  as  células  de  Zymomonas  mobilis 
recombinantes  que  metabolizam  a  xilose  demonstram  lento  e  incompleto 
consumo  da  mesma.  As  possíveis  causas  relacionadas  para  tal  deficiência 
remetem ao microrganismo não possui transportador específico para a xilose, o 
que  prejudica  a  sua  metabolização  devido  à  repressão  catabólica  pelo 
monossacarídeo  preferencial,  a  glicose.  Adicionalmente,  estudos  de 
modelagem indicam que a captação de glicose e xilose ocorre em 65% e 35%, 
respectivamente,  quando  estes  carboidratos estão  presentes na  proporção  de 
1:1  (LEKSAWASDI  et  al.,  2001).  Jeon  et  al.  (2005);  Zhang  &  Chen  (2009)  e 
Agrawal  et  al  (2011)  também  afirmam  que  a  maior  problemática  da 
fermentação de pentoses está relacionada à produção e acumulação de xilitol, 
mesmo  em  concentrações  reduzidas,  promovendo  o  desvio  da  via  das 
pentoses  em  linhagens  recombinantes  de  Z.  mobilis.  Segundo  Kim  et  al. 
(2000), apenas 1 g/L de xilitol presente no meio pode provocar redução de 50% 
do crescimento de biomassa.  
Agrawall  et  al.  (2011)  reportaram  sobre  a  importância  da  adaptação 
metabólica  frente  à  produção  de  etanol  por  Z.  mobilis  ZM4  (pZB5),  visando  à 
obtenção  de  resultados  mais  promissores.  Adicionalmente,  tal  linhagem  tem 
sido apontada  como  uma  das  mais  indicadas  para a  metabolização  da  xilose, 
além de possuir maior resistência ao etanol, ao ácido acético e furfural.  Zhang 
(2003) indicaram que a linhagem CP4, a qual produziu 24 g/L de etanol a partir 
de  15  g/L  de  glicose  e  35  g/L  de  xilose,  não  seria  tão  eficiente  quanto  à 
linhagem  8b  (ZHANG  et  al.,  2010),  a  qual  atingiu  40  g/L  de  etanol  a  partir  de 
resíduo  de papel,  um  dos  motivos  pelos quais  os  resultados  da presente  tese 
podem não estar atingindo elevados níveis de etanol.  
Neste  contexto,  as  dificuldades  de  metabolização  de  xilose  pela 
linhagem recombinante de Z. mobilis CP4, desenvolvida neste trabalho, podem 
também estar relacionadas à inibição do crescimento microbiano pela produção 
de xilitol, uma vez que tal composto foi detectado nos ensaios de fermentação 
do  presente  trabalho.  Portanto,  conforme  indicado  por  diversos  autores  e 
comprovado  neste  trabalho,  os  processos  de  adaptação  metabólica,  assim 
como otimizações empregando a linhagem recombinante de  Z. mobilis devem 

CAPÍTULO 5: Resultados e Discussões 
 
Danielle da Silveira dos Santos 
169     
ser  contínuos  no  que  tange  à  maximização  da  produção  de  etanol  e  de 
biomassa microbiana, assim como à redução da produção de xilitol.  
5.3.  CONSIDERAÇÕES GERAIS  
Através  de  estudos  realizados  neste  trabalho,  assim  como  o 
levantamento  bibliográfico  de  diversas  pesquisas  científicas  sobre  a  biologia 
molecular  e  bioquímica  do  microrganismo  Zymomonas  mobilis,  conclui-se  que 
a engenharia genética e a metabólica ainda apresentam-se como as melhores 
e  possivelmente  as  únicas  alternativas  para  tornar  esta  bactéria  capaz  de 
fermentar a níveis industriais. No entanto, a tecnologia de fermentação a partir 
de  materiais  lignocelulósicos  ainda  não  superou  alguns  fatores  inibitórios 
responsáveis  pela  redução  do  rendimento  do  processo;  dentre  eles, 
temperaturas  elevadas,  estresse  osmótico,  elevados  níveis  de  etanol,  bem 
como  a  limitada  gama  de  substratos  fermentáveis,  juntamente  com  a 
problemática de metabolização de pentoses.  
Contudo,  uma  vez  que  a  bactéria  Zymomonas  mobilis  desponta  como 
um dos microrganismos mais promissores para a produção de etanol, diversos 
pesquisadores  tentam  contornar  algumas  dificuldades  relacionadas  à 
fermentação  na  presença  de  compostos  inibitórios,  dentre  outros  estresses 
fisiológicos.  Neste  contexto,  o  grupo  de  pesquisa  NREL  (EUA),  o  qual  estuda 
há cerca de duas décadas a fermentação por Z. mobilis é um dos pioneiros no 
desenvolvimento  e  aprimoramento  de  diversas  tecnologias  utilizando  tal 
microrganismo.  Buscando  superar  as  dificuldades  metabólicas  citadas 
anteriormente, no intuito de que a fermentação por Z. mobilis atinja níveis cada 
vez mais elevados, pesquisadores avaliam o emprego de diferentes linhagens, 
o  isolamento  de  diferentes  colônias,  assim  como  o  aprimoramento  das 
tecnologias  de  adaptação  metabólica  e  engenharia  genética.  Pesquisas 
preliminares realizadas por Yang et al. (2010) avaliaram a adição do gene Hfq, 
o  qual  coordena  diversas  respostas  ao  estresse  fisiológico  de  alguns 
microrganismos. Zhou et al. (2011) avaliaram a integração XI, XK, TAL, TKL no 
genoma de Z. mobilis ZM-mtc9xt, obtendo resultados promissores, assim como 
outros grupos de pesquisa apontaram para a otimização do processo sem que 

CAPÍTULO 5: Resultados e Discussões 
 
Danielle da Silveira dos Santos 
170     
houvesse outra intervenção genética,  através da utilização do processo SSCF 
empregando-se  baixos  níveis  de  carga  enzimática,  conforme  relatado  por 
Olofsson  et  al.  (2010).  No  Brasil,  estudos  empregando  técnicas  de  biologia 
molecular  neste  microrganismo  são  muito  recentes.  O  centro  de  pesquisa 
LADEBIO é pioneiro nesta temática, empregando tal bactéria, transformando-a 
e  desenvolvendo  otimizações  do  processo  de  hidrólise  enzimática  e  co-
fermentação  simultâneas  (SSCF)  a  partir  de  um  resíduo  agro-industrial,  o 
bagaço de cana-de-açúcar. Desta forma, almeja-se que em um futuro próximo 
se  possam  empregar  recursos  renováveis  no  que  tange  à  bioconversão  de 
açúcares a etanol por tal microrganismo.  
 
  Sumariamente,  o  objetivo  e  o  desenho  experimental  adotado  para  a 
execução  do  presente  trabalho,  pautaram-se,  fundamentalmente,  no 
desenvolvimento  de  tecnologias  para  a  otimização  da  produção  de  etanol  a 
partir de resíduos lignocelulósicos, mediante o uso de linhagens nativas (AG11 
e  CP4),  através  do  processo  SSF  e  da linhagem  recombinante  CP4,  a  qual  é 
capaz de fermentar a xilose e a glicose simultaneamente, através do processo 
SSCF. Baseado no teste de fermentabilidade empregando as linhagens nativas 
de  Z.  mobilis,  realizado  com  o  bagaço  de  cana-de-açúcar  e  com  resíduos  da 
indústria  de  celulose,  conclui-se  que  estas  matérias-primas  apresentaram 
significativos  potenciais  para  a  produção  de  etanol  2G,  sendo  facilmente 
fermentados.  Constatou-se,  portanto,  que  a  celulose  constitui  uma  excelente 
fonte  de  carboidratos  para  a  execução  do  processo  de  hidrólise  enzimática  e 
fermentação  simultâneas  por  Zymomonas  mobilis,  que  se  apresentou 
promissora  para  a  produção deste biocombustível,  em  virtude  de  sua  elevada 
capacidade  de  absorção  de  glicose,  altas  taxas  específicas  de  produção  de 
etanol, resultando em altos valores de produtividade. Os resultados alcançados 
com  o  presente  trabalho  foram  satisfatórios,  no  entanto,  são  necessárias 
continuações  no  que  tange  à  elaboração  de  novas  estratégias  para  que  as 
questões  inibitórias  e  insatisfatórias  colocadas  ao  longo  do  texto  sejam 
contornadas, assim como o desenvolvimento de técnicas de biologia molecular 
para  a  comprovação  da  transformação  genética,  gerando  oportunidades  para 
futuros 
e 
interessantes 
desenvolvimentos 
tecnológicos.

CAPÍTULO 6: Conclusões e Sugestões 
 
 
Danielle da Silveira dos Santos 
171 
                                                             
_____________________CAPÍTULO 6 
CONCLUSÕES  
 
6.1. CONCLUSÕES 

  Após  análise  da  capacidade  de  utilização  de  glicose  em  meio  sintético 
pelas linhagens de Z. mobilis AG11 e CP4, observou-se que o substrato foi 
consumido  eficientemente  em  um  período  de  15  e  18  horas, 
respectivamente.  No  tocante  ao  consumo  de  xilose,  foi  constatada  a 
incapacidade de ambas as linhagens nativas em metabolizar esta pentose.   

  Através  de  técnicas  de  planejamento  experimental  foi  possível  constatar 
que  o  uso  do  tampão-citrato  (1M,  pH  5, 50%  v/v)  adicionado  à  celulignina 
de bagaço de cana pré-tratada alcalinamente, influenciou negativamente a 
produção  de  etanol  pelas  linhagens  de  Zymomonas  mobilis.  Neste 
planejamento,  as  linhagens  de  Z.mobilis  AG11  e  CP4  atingiram 
concentrações  de  etanol  de  25  e  34  g/L,  correspondendo  a  valores  de 
produtividade volumétrica de 1,04 e 1,25 g/L.h, respectivamente. Tendo em 
vista  que  os  melhores resultados  foram  alcançados  com  a  linhagem  CP4, 
os estudos posteriores foram realizados com esta linhagem. 

  Foi  construído  um  novo  planejamento  experimental,  otimizando-se  a 
concentração  de  glicose  inicial  do  SSF,  a  produção  etanol  e  a 
produtividade  volumétrica  do  processo  SSF  com  bagaço  de  cana  pré-
tratado. 
As 
melhores 
condições 
experimentais, 
apontadas 
pelo 
planejamento  experimental  foram:  relação  sólido:líquido  de  3:10  (g:mL), 

CAPÍTULO 6: Conclusões e Sugestões 
 
 
Danielle da Silveira dos Santos 
172 
carga  enzimática  de  25  FPU/g  e  concentração  inicial  de  células  de  4  g/L. 
As concentrações máximas atingidas foram de 76 g/L de glicose inicial, 60 
g/L de etanol, e produtividade volumétrica de 1,52 g/L.h, na temperatura de 
30ºC  e  velocidade  de  agitação  de  150  rpm,  em  frascos  agitados.  A 
validação  em  biorreator  instrumentado  resultou  em  uma  concentração  de 
etanol  de  55  g/L,  iniciando-se  o  processo  SSF  com  a  concentração  de 
glicose  de  80  g/L  (após  etapa  de  pré-hidrólise  enzimática).  O  valor  de 
produtividade  volumétrica  atingido  nesta  escala  foi  de  2,29  g/L.h,  em 
temperatura de 30ºC, velocidade de agitação de 150 rpm e pH 5.  

  Através da execução de um Planejamento Fatorial 2
4
 foi possível constatar 
que os nutrientes analisados: KH
2
PO
4
 (g/L), MgSO
4
.7H
2
O(g/L) e (NH
4
)
2
SO
4
 
e  extrato  de  levedura  (g/L),  adicionados  no  processo  SSF,  promoveram 
maiores concentrações de etanol quando estavam em seus maiores níveis: 
1  g/L,  0,5  g/L,  0,5  g/L  e  2,5  g/L,  respectivamente.  Posteriormente,  foi 
desenvolvido  um  Planejamento  Experimental  de  Superfície  de  Resposta, 
aumentando-se a faixa de estudo dos nutrientes, além da adição dos níveis 
axiais. As condições ótimas foram: extrato de levedura (12,5 g/L), KH
2
PO
4
 
(2,5  g/L),  (NH
4
)
2
SO
4
  (1,5  g/L)  e  MgSO
4
  (1,5  g/L),  resultando  na 
concentração  máxima  de  etanol  de  65  g/L,  com  85  g/L  de  concentração 
inicial de glicose, atingindo a maior produtividade volumétrica de 2,70 g/L.h, 
na temperatura de 30ºC, agitação orbital de 150 rpm, pH 5 em biorreator. 

  O resíduo da indústria de celulose, PM2, foi avaliado quanto à produção de 
etanol a partir do processo  SSF, sendo as condições ótimas as seguintes: 
relação  sólido:líquido  (2:10  g/mL),  carga  enzimática  (17,5  FPU/g)  e 
concentração  celular  (1,59%  v/v),  resultando  na  máxima  concentração  de 
etanol  em  58  g/L,  a  partir  de  82  g/L  de  glicose  inicial  e  produtividade 
volumétrica de 2,76 g/L.h. As condições ótimas obtidas  através da análise 
da  adição  de  nutrientes  no  meio  SSF  para  a  produção  de  etanol  a  partir 
dos resíduos da indústria de celulose, foram: extrato de levedura (6,25 g/L), 
KH
2
PO
4 
(1,25 g/L), (NH
4
)
2
SO
4
 (2,25 g/L) e MgSO
4
 (2,25 g/L), resultando na 
máxima  concentração  de  etanol  de  54  g/L,  a  partir  de  91  g/L  de  glicose 

CAPÍTULO 6: Conclusões e Sugestões 
 
 
Danielle da Silveira dos Santos 
173 
inicial  e  produtividade  volumétrica  de  3,6  g/L.h,  em  biorreator 
instrumentado, na temperatura de 30ºC, 150 rpm de agitação e pH 5. 

  No  que  tange  à  transformação  genética  no  microrganismo  em  estudo, 
observou-se que após tal procedimento, o mesmo apresentou crescimento 
em meio RMG (20 g/L de glicose, 2 g/L de KH
2
PO
4
 e 10 g/L de extrato de 
levedura) adicionado de tetraciclina (10 mg/L). A adaptação metabólica em 
meio  sintético  foi  desenvolvida  com  o  intuito  de  promover  resultados  mais 
promissores  de  crescimento  e  produção  de  etanol.  Este  procedimento 
constituiu  de  50  ciclos  nos  quais  aumentava  progressivamente  a 
concentração de xilose e reduzia-se proporcionalmente a de glicose. Após 
o  20
o
  ciclo  de  repiques,  o  tempo  de  crescimento  bacteriano  reduziu  para 
cerca  de  70  horas,  aumentando  lentamente  o  consumo  de  xilose  e 
acelerando  o  crescimento  celular.  Após  a  realização  de  50  ciclos  de 
adaptação  metabólica,  a  bactéria  apresentou  maiores  valores  de 
crescimento de biomassa, produção de etanol e produtividade volumétrica, 
indicando que as colônias adaptadas (ciclo 40 a 50) apresentaram  melhor 
desempenho  do  que  aquelas  cultivadas  nos  primeiros  ciclos,  com  valores 
destes  parâmetros  aumentando  no  mínimo  em  2  vezes.  Através  de 
experimentos avaliando diferentes concentrações de glicose e xilose foram 
alcançados 7,5 g/L de etanol após 72 horas, a partir de 20 g/L de glicose, 
20 g/L de xilose, em meio RMGX na temperatura de 30
o
C, sem agitação.  

  O  processo  de  hidrólise  enzimática  e  co-fermentação  simultâneas  foi 
avaliado 
segundo 
Planejamentos 
Experimentais 
seqüenciais 
2
2
, 
empregando  a  bactéria  Zymomonas  mobilis  recombinante,  na  temperatura 
de 30ºC, 150 rpm de agitação, pH 5, durante 52 horas totais, resultando na 
máxima concentração de etanol de 25,3 g/L e produtividade volumétrica de 
0,65  g/L.h,  a  partir  de  20,5%  (v/v)  de  hidrolisado  hemicelulósico,  2,99:10 
(g:mL)  de  relação  sólido:líquido  de  bagaço  de  cana  de  açúcar  pré-tratado, 
em  biorreator  instrumento.  Constatou-se  que  a  glicose  foi  inicialmente 
metabolizada,  seguida  da  xilose,  a  qual  foi  consumida  em  cerca  de  50%, 
havendo desvio da rota para a produção de xilitol.  

CAPÍTULO 6: Conclusões e Sugestões 
 
 
Danielle da Silveira dos Santos 
174 
6.2. SUGESTÕES 
I.    Processo SSF empregando a linhagem nativa de Z. mobilis  
As  concentrações  ótimas  de  hidrolisado  celulósico  do  bagaço  de  cana, 
bem  como  do  resíduo  da  indústria  de  celulose  podem  ser  selecionadas  para 
alimentar  um  processo  de  fermentação  contínuo  ou  em  batelada  alimentada. 
Esta forma de condução permitiria estender a fase exponencial de crescimento 
e controlar os níveis de substrato, evitando assim, os efeitos repressores sobre 
o metabolismo da bactéria. 
II.   Processo SSCF empregando a linhagem recombinante de Z. mobilis  
Conforme  descrito  anteriormente,  o  mecanismo  gênico  de  tal  bactéria 
não  regula  corretamente  a  expressão  dos  genes  inseridos.  Visando  contornar 
esta  problemática,  as  sugestões  abaixo  visam  à  superação  dos  resultados 
obtidos  pela  linhagem  recombinante  de  Z.  mobilis  desenvolvida  no 
LADEBIO/UFRJ, 
em 
colaboração 
com 
o 
Laboratório 
de 
Biologia 
Molecular/UnB.  

  Quantificar níveis enzimáticos através de análise química das atividades de 
xilose isomerase, xiluloquinase, transaldolase e transquetolase; 

  Caracterização  das  proteínas  heterólogas  inseridas  na  linhagem  parental, 
através de Cromotografia Eletroforética; 

  Sequenciar  o  DNA  da  linhagem  recombinante,  bem  como  da  linhagem 
nativa,  com  a  finalidade  de  comprovar  a  inserção  dos  genes  no 
microrganismo e de detectar possíveis mutações;  

  Desenvolver  uma  linhagem  recombinante  que  possua,  além  dos  genes  de 
metabolização da xilose, os genes que codificam o transporte específico da 
pentose; 
 

  Investigar  a  integração  cromossomal  de  genes  responsáveis  pela 
metabolização de xilose e arabinose.  
 

CAPÍTULO 8: Referências Bibliográficas 
 
175 
 
 
 
Danielle da Silveira dos Santos 
 
                                                                      
_____________________CAPÍTULO 7 
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
ABUD,  A.  K.  S.  (2005)  Estudo  do  controle  de  qualidade  do  processo  de 
produção de L-asparaginase por Zymomonas mobilis.  Tese de Doutorado. 
Programa  de  Pós-Graduação  em  Engenharia  Química  da  COPPE. 
Universidade Federal do Rio de Janeiro, RJ, Brasil. 
AGRAWAL,  M.;  CHEN,  R.  R.  Discovery  and  characterization  of  a  xylose 
reductase  from  Zymomonas  mobilis  ZM4.  Biotechnology  Letters,  v.  33,  n. 
11, p. 2127-2133, 2011.  
AGRAWAL,  M.;  MAO,  Z.;  CHEN,  R.  R.  Adaptation  Yields  a  Highly  Efficient 
Xylose-Fermenting  Zymomonas  mobilis  Strain.  Biotechnology  and 
Bioengineering, v. 108, n. 4, 2011. 
AIMARETTI,  M.;  YBALO,  C.  Valorization  of  carrot  and  yeast  discards  for  the 
obtention of ethanol. Biomass and Bioenergy, v. 42, p. 18-23, 2012.  
AKINTERINWA,  O.;  CIRINO,  P.  C.  Heterologous  expression  of  D-xylulokinase 
from  Pichia  stipitis  enables  high  levels  of  xylitol  production  by  engineered 
Escherichia  coli  growing  on  xylose.  Metabolic  Engineering,  v.  11,  n.  1,  p. 
48
–
55, 2009. 

CAPÍTULO 8: Referências Bibliográficas 
 
176 
 
 
 
Danielle da Silveira dos Santos 
 
ALGAR,  E.  M.;  SCOPES,  R.  K.  Studies  on  cell-free  metabolism:  ethanol 
production by extracts of  Zymomonas mobilis. Journal Biotechnology, v. 2, 
p. 275-287, 1985. 
ALLF-STEINBERGER, C. Evidence for coding pattern on the non-coding strand 
of the E. coli genome. Nucleic Acids Research, v. 12, p.2235-2241, 1984. 
ALTERTHUM,  F.;  INGRAM,  L.  O.  Efficient  ethanol-production  from  glucose, 
lactose,  and  xylose  by  recombinant  Escherichia  coli.  Applied  and 
Environmental Microbiology, v. 55, p. 1943
–
8, 1989. 
ALVES, T. L. M. Estudo da Produção de etanol por Zymomonas mobilis. 
Tese de Doutorado. PEQ/COPPE, Universidade Federal do Rio de 
Janeiro, Rio de Janeiro, 1993. 
AMARAL,  L.  A.  Atividade  física  e  diferença  significativa/deficiência:  algumas 
questões  psicossociais  remetidas  à  inclusão/convívio  pelo.  In:  Congresso 
Brasileiro De Atividade Motora Adaptada, 4., 2001, Curitiba. Anais Curitiba: 
SOBAMA, 2001. p. 30-31. 
AMARTEY,  S.;  JEFFRIES,  T.  An improvement  in  Pichia  stipits  fermentation  of 
acid-hydrolysed  hemicellulose  achieved  by  overliming  (calcium  hydroxide 
treatment)  and  strain  adaptation.  World  Journal  of  Microbiology  and 
Biotechnology, v. 12, n. 3, p.281
–
3. 1996.  
AMOREA,  A.;  FARACOA,  V.  Potential  of  fungi  as  category  I  Consolidated 
Bioprocessing  organisms  for  cellulosic  ethanol  production.  Renewable  and 
Sustainable Energy Reviews, v. 16, p. 3286
–
 3301, 2012. 
AMUTHA,  R.;  GUNASEKARAN,  P.  Production  of  ethanol  from  liquefied 
cassava  starch  using  co-immobilized  cells  of  Zymomonas  mobilis  and 
Saccharomyces  diastaticus.Journal  of  Bioscience  and  Bioengineering,  v. 
92, p. 560
–
564, 2001. 
ANP,  Agência  Nacional  do  Petróleo,  Gás  Natural  e  Biocombustíveis  (2006) 
Disponível em: