Ocorrente e recombinante, empregando

Tabela  5.9.  Análise  da    variância  da  produção  de  etanol,  empregando 
diferentes  concentrações  de  extrato  de  levedura,  KH
2
PO
4
,  (NH
4
)
2
SO
4
  e 
MgSO
4
.7H
2
O,  através  do  processo  SSF  a  partir  de  bagaço  de  cana  pré-
tratado por Zymomonas mobilis CP4. 
 
SQ 
GL 
MQ 
Fisher 
p>F 
Modelo 
3546,6 
15 
236,6 
25,4 
0,038 
A 
295,6 
1 
295,6 
31,6 
0,030 
B 
303,0 
1 
303,0 
32,4 
0,029 
C 
7,9 
1 
7,9 
0,8 
0,455 
D 
67,1 
1 
67,1 
7,1 
0,115 
AB 
13,9 
1 
12,91 
1,3 
0,360 
AC 
794,8 
1 
794,8 
85,6 
0,011 
AD 
449,1 
1 
449,1 
48,1 
0,020 
BC 
309,5 
1 
309,5 
33,1 
0,028 
BD 
383,8 
1 
383,9 
41,1 
0,023 
CD 
282,5 
1 
282,5 
30,2 
0,031 
ABC 
21,1 
1 
21,1 
2,2 
0,271 
ABD 
11,6 
1 
11,6 
1,2 
0,380 
ACD 
14,5 
1 
14,6 
1,5 
0,338 
BCD 
0,4 
1 
0,4 
0,03 
0,864 
ABCD 
595,7 
1 
595,7 
63,8 
0,015 
Curvatura 
1963,9 
1 
1963,9 
210,4 
0,004 
Erro 
18,7 
2 
9,3 
 
 
Cor. Total 
5532,1 
18 
 
 
 
SQ: Soma quadrática, GL: Grau de liberdade, MQ:Média quadrática, p>F: p-valor. 
A: Extrato de levedura, B: KH
2
PO
4
, C: (NH
4
)
2
 SO
4
, D: MgSO
4
.7H
2
O. 
 
Os experimentos em frascos agitados foram  reproduzidos em biorreator 
sob  condições  controladas,  nas  seguintes  condições  operacionais:  relação 
sólido  líquido  de  3:10  (g:mL),  carga  enzimática  de  25  FPU/g  de  celulignina  e 

CAPÍTULO 5: Resultados e Discussões 
 
Danielle da Silveira dos Santos 
133     
concentração  inicial  de  células  de  4  g/L  (SANTOS  et  al.,  2010)  (Figura  5.13). 
Após  a  pré-hidrólise  enzimática,  a  bactéria  foi  inoculada,  dando  início  ao 
processo SSF, atingindo 53 g/L de etanol e produtividade volumétrica de  2,20 
g/L.h.  
 
Figura  5.13.  Perfil  cinético  do  processo  de  hidrólise  enzimática  de  celulose  e 
fermentação simultâneas a partir de bagaço de cana pré-tratado por Z. mobilis 
CP4, nas melhores condições preconizadas pelo modelo: 2,5 g/L de extrato de 
levedura,  1  g/L  de  KH
2
PO
4
,  0,5  g/L  de  (NH
4
)
2
SO
4
  e  0,5  g/L  de  MgSO
4
.7H
2
O, 
atingindo  53  g/L  de  etanol,  em  biorreator  instrumentado.  Condições 
operacionais:  relação  sólido  líquido  de  3:10  (g:mL),  carga  enzimática  de  25 
FPU/g  e  concentração  inicial  de  células  de  4  g/L.  P.H.=  pré-hidrólise 
enzimática, SSF: fermentação e sacarificação simultâneas. 
Através deste estudo preliminar foi possível constatar que os nutrientes 
analisados:  KH
2
PO
4
  (g/L),  MgSO
4
.7H
2
O(g/L),  (NH
4
)
2
SO
4
  e  extrato  de levedura 
(g/L) promoveram  maiores concentrações de etanol quando estavam em seus 
maiores níveis: 1  g/L, 0,5 g/L, 0,5 g/L e 2,5 g/L, respectivamente. No entanto, 
houve  a  necessidade  de  ser  feito  um  planejamento  experimental  completo 
visando  à  otimização  da  produção  de  etanol,  uma  vez  que  a  curvatura 
apresentou-se  significativa  (p<0,05).  Desta  forma,  foram  adicionados  pontos 
axiais,  promovendo  os  graus  de  liberdade  necessários  para  a  elaboração  de 
um modelo quadrático que permita maximizar a concentração de etanol. 
SSF 
P.H.  

CAPÍTULO 5: Resultados e Discussões 
 
Danielle da Silveira dos Santos 
134     
Planejamento Composto Central Rotacional  
Conforme  descrito  anteriormente,  um  planejamento  fatorial  2
4
  foi 
realizado;  no  entanto,  foi  recomendado  empregar  o  método  de  Superfície  de 
Resposta, adequado para identificar o efeito de variáveis individuais, buscando 
então  por  melhores  condições  para  um  sistema  multivariável  eficiente, 
conforme demonstrado na tabela 5.10 (YU et al., 2009).  
Tabela  5.10.  Planejamento  Composto  Central  2
4
,  avaliando  efeitos  da  adição 
de  extrato  de  levedura  (g/L),  KH
2
PO
4
  (g/L),  (NH
4
)
2
SO
4
  (g/L)  e  MgSO
4
.7H
2
O 
(g/L)  na  produção  de  etanol  através  do  processo  SSF  a  partir  de  bagaço  de 
cana  pré-tratado,  na  relação  sólido:líquido  3:10  (g:mL)  e  carga  enzimática  de 
25 FPU/ g, por Z. mobilis CP4.  
  
Exp. 
Variáveis 
Resposta 
E. L.  
(g/L) 
KH
2
PO
4 
(g/L) 
(NH
4
)
2
SO
4 
(g/L) 
MgS0
4
.7H
2
0 
(g/L) 
Etanol  
(g/L) 
1 
6,25 
1,25 
0,75 
0,75 
54,2 
2 
18,75 
1,25 
0,75 
0,75 
62,6 
3 
6,25 
3,75 
0,75 
0,75 
45,7 
4 
18,75 
3,75 
0,75 
0,75 
59,3 
5 
6,25 
1,25 
2,25 
0,75 
38,1 
6 
18,75 
1,25 
2,25 
0,75 
60,3 
7 
6,25 
3,75 
2,25 
0,75 
34,8 
8 
18,75 
3,75 
2,25 
0,75 
52,4 
9 
6,25 
1,25 
0,75 
2,25 
32,9 
10 
18,75 
1,25 
0,75 
2,25 
57,8 
11 
6,25 
3,75 
0,75 
2,25 
33,2 
12 
18,75 
3,75 
0,75 
2,25 
56,4 
13 
6,25 
1,25 
2,25 
2,25 
28,5 
14 
18,75 
1,25 
2,25 
2,25 
54,7 
15 
6,25 
3,75 
2,25 
2,25 
48,1 
16 
18,75 
3,75 
2,25 
2,25 
63,0 
17 
0,0 
2,5 
1,5 
1,5 
30,4 
18 
25,0 
2,5 
1,5 
1,5 
65,4 
19 
12,5 
0,0 
1,5 
1,5 
33,6 
20 
12,5 
5,0 
1,5 
1,5 
38,2 
21 
12,5 
2,5 
0,0 
1,5 
34,9 
22 
12,5 
2,5 
3,0 
1,5 
37,3 
23 
12,5 
2,5 
1,5 
0,0 
34,1 
24 
12,5 
2,5 
1,5 
3,0 
62,7 
25 
12,5 
2,5 
1,5 
1,5 
65,2 
26 
12,5 
2,5 
1,5 
1,5 
63,4 
27 
12,5 
2,5 
1,5 
1,5 
62,6 
28 
12,5 
2,5 
1,5 
1,5 
61,3 
29 
12,5 
2,5 
1,5 
1,5 
62,8 
30 
12,5 
2,5 
1,5 
1,5 
60,0 
Onde: E.L.: e
xtrato de levedura. 

CAPÍTULO 5: Resultados e Discussões 
 
Danielle da Silveira dos Santos 
135     
Os  parâmetros  analisados  foram  os  mesmos  do  Planejamento  Fatorial, 
concentrações  de  extrato  de  levedura,  KH
2
PO
4
,  (NH
4
)
2
SO
4
  e  MgSO
4
.7H
2
O, 
adicionados  à  celulignina  pré-tratada  no  início  da  hidrólise,  que  junto  com  a 
glicose  gerada,  permitiu  a  implementação  do  processo  de  sacarificação  e 
fermentação simultâneas. A maior concentração de etanol obtida foi de  65 g/L, 
com 12,5 g/L de extrato de levedura, 2,25 g/L de KH
2
PO
4
, 1,5 g/L (NH
4
)
2
SO
4
 e 
1,5  g/L  de  MgSO
4
.7H
2
O.  A  presença  de  maiores  concentrações  de  extrato de 
levedura,  rico  em  nitrogênio,  aumentou  significativamente  a  produção  de 
etanol,  como  indicado  pela  comparação  dos  experimentos  9  e  10.  Estes 
possuem as mesmas concentrações de nutrientes, entretanto, quando o extrato 
de levedura  foi  acrescentado,  a  produção  de  etanol aumentou  de  18  g/L  a  40 
g/L.  
Nos experimentos de 17, 19, 21 e 23, os quais não foram adicionados de 
extrato de levedura (g/L), KH
2
PO
4
 (g/L), (NH
4
)
2
SO
4
 (g/L) e MgSO
4
.7H
2
O (g/L), o 
etanol  foi  produzido  nas  concentrações  de  11,  37,  26  e  26  g/L, 
respectivamente.  Adicionalmente,  comparando  os  resultados  entre  os 
experimentos  1  e  15,  nota-se  que  o  efeito  sinérgico  entre  os  parâmetros 
analisados  faz-se  necessário,  uma  vez  que  foram  empregadas  baixas 
concentrações  de  todos  os  nutrientes  adicionados,  assim  como  elevadas 
concentrações dos mesmos, com exceção de extrato de levedura, atingindo 38 
g/L e 15 g/L de etanol, respectivamente. 
A  análise  estatística  de  variância  obtida  pelo  Planejamento  Composto 
Central  Rotacional,  indicado  na  tabela  5.11,  mostra  que  o  modelo  foi  muito 
significativo,  com  p<0,05,  apresentando  elevado  coeficiente  de  determinação 
total (R
2
) observado para a resposta ao etanol, em 0,995. Além disso, o resíduo 
foi baixo e não significativo (p>0,05), o que não invalidou o modelo para fins de 
preditivos.  
O modelo da concentração de etanol é apresentado na equação (5). 
[Etanol]=+52.17+131,29A+3,05B+2,50C+6,59D1,00AB+0,38AC+2,00AD+1,50B
C+3,63BD+3,50CD+8,65A
2
-5,07B
2
-5,04C
2
-59D
2
-0,88ABC-1,25ABD- 
1,88ACD+1,50BCD-2,43A
2
B-3,50A
2
C-8,96A
2
D-85,12AB
2
-36,42A
3
          (5)     

CAPÍTULO 5: Resultados e Discussões 
 
Danielle da Silveira dos Santos 
136     
Tabela 5.11. 
Análise de variância da produção de etanol, empregando diferentes 
concentrações de extrato de levedura, KH
2
PO
4
, (NH
4
)
2
SO
4
 e MgSO
4
.7H
2
O, através 
do processo SSF a partir do bagaço de cana pré-tratado, na relação sólido:líquido 
3:10 (g:mL) e carga enzimática de 25 FPU/ g, por Z. mobilis CP4.
 
 
SQ 
GL 
MQ 
F-Valor 
p > F  
Modelo 
4892,51 
22 
222,39 
69,32 
< 0,0001 
A 
481,44 
1 
481,44 
150,06 
< 0,0001 
B 
749,55 
1 
749,55 
233,62 
< 0,0001 
C 
72,52 
1 
72,52 
22,60 
0,0021 
D 
301,53 
1 
301,53 
93,98 
< 0,0001 
AC 
7,56 
1 
7,56 
2,36 
0,1686 
AD 
45,56 
1 
45,56 
14,20 
0,0070 
BC 
52,56 
1 
52,56 
16,38 
0,0049 
BD 
175,56 
1 
175,56 
54,72 
0,0001 
CD 
162,56 
1 
162,56 
50,67 
0,0002 
A
2
 
360,80 
1 
360,80 
112,46 
< 0,0001 
B
2
 
174,42 
1 
174,42 
54,37 
0,0002 
C
2
 
1046,50 
1 
1046,50 
326,18 
< 0,0001 
D
2
 
534.53 
1 
534.53 
166.61 
< 0.0001 
ABC 
22.56 
1 
22.56 
7.03 
0.0329 
ABD 
14.06 
1 
14.06 
4.38 
0.0746 
ACD 
39.06 
1 
39.06 
12.18 
0.0101 
BCD 
52.56 
1 
52.56 
16.38 
0.0049 
A
2
B 
749.31 
1 
749.31 
233.55 
< 0.0001 
A
3
 
13.48 
1 
13,48 
4,20 
0,0795 
B
3
 
726,28 
1 
726,28 
226,37 
< 0,0001 
C
3
 
103,83 
1 
103,83 
32,36 
0,0007 
D
3
 
567,00 
1 
567,00 
176,73 
< 0,0001 
Resíduo 
22,46 
7 
3,21 
 
 
Lack of Fit 
7,62 
2 
3,81 
1,29 
0,3545 
Erro Puro 
14,83 
5 
2,97 
 
 
Cor Total 
4914,97 
29 
 
 
 
SQ= Soma dos Quadrados, GL=Grau de Liberdade, MQ=Média Quadrática,  
A: Extrato de levedura, B: KH
2
PO
4
, C: (NH
4
)
2
 SO
4
, D: MgSO
4
.7H
2
O. 
 
A  variável  B  (KH
2
PO
4
)  apresentou  maior  influência  no  modelo,  seguida 
da  A  (extrato  de levedura),  por  sua  vez  a  D (MgSO
4
.7H
2
O)  e,  finalmente,  a  C 
([NH
4
]
2
SO
4
),  que  possui  baixos  valores  de  Soma  dos  Quadrados.  A  interação 
das  variáveis  também  resultou  em  altos  valores  de Fisher,  o  que  aponta  para 
um  elevado  sinergismo  entre  os  nutrientes  na  fermentação  por  Z.  mobilis, 
promovendo  maior  produção  de  etanol.  A  interação  entre  B  e  D  (KH
2
PO
4
  e 
MgSO
4
.7H
2
O)  mostrou-se  a  mais  significativa  estatisticamente,  seguida  da 
interação  entre  C  e  D  ([NH
4
]
2
SO
4 
e  MgSO
4
.7H
2
O)  e  entre  B  e  C  (KH
2
PO
4
  e 
[NH
4
]
2
SO
4
).  As  interações  duplas  entre  os  nutrientes  analisados  para  a 

CAPÍTULO 5: Resultados e Discussões 
 
Danielle da Silveira dos Santos 
137     
produção  de  etanol  indicam  que  a  interação  entre  KH
2
PO
4 
(g/L)  e  extrato  de 
levedura  (g/L)  é  reduzida,  sendo  retirada  do  modelo.  No  entanto,  o  KH
2
PO
4
, 
possui  elevadas  interações  entre  as  variáveis  representadas  por  (NH
4
)
2
SO
4
 
(g/L) e MgSO
4
.7H
2
O (g/L). 
A  Figura  5.14  mostra  os  gráficos  de  superfície  de  resposta, 
apresentando a interação entre os parâmetros A, B, C e D, que representam o 
extrato  de  levedura,  o  KH
2
PO
4
,  o  (NH
4
)
2
SO
4
,  assim  como
 
o  MgSO
4
.7H
2
O, 
respectivamente.  
 
Figura  5.14.  Superfície  de  resposta  mostrando  efeitos  de  MgSO
4
.7H
2
O  (g/L)  e 
(NH
4
)
2
SO
4 
(A),
 
KH
2
PO
4
  (g/L)  e  MgSO
4
.7H
2
O  (g/L)  (B),  KH
2
PO
4
  (g/L)  e  (NH
4
)
2
SO
4 
(C)e  suas  interações  para  a  produção  de  etanol  através  do  processo  SSF  por  Z. 
mobilis CP4 a partir do bagaço de cana pré-tratado, na relação sólido:líquido 3:10 
(g:mL) e carga enzimática de 25 FPU/ g. 

CAPÍTULO 5: Resultados e Discussões 
 
Danielle da Silveira dos Santos 
138     
Na  figuras  5.14  (A)  (interação  entre  o  MgSO
4
.7H
2
O  e  o  (NH
4
)
2
SO
4
)  e 
5.14  (B)  (interação  entre  o  MgSO
4
  e  o  KH
2
PO
4
),  a  produção  de  etanol 
encontra-se  em  seu  nível  ótimo  quando  os  mesmos  encontram-se  dos  seus 
níveis mínimos aos pontos centrais, mantendo os outros parâmetros nos níveis 
médios. Já a figura 5.14 (C) mostra que a produção de etanol está em seu nível 
ótimo quando as variáveis B e C, KH
2
PO
4
 (g/L) e (NH
4
)
2
SO
4
, respectivamente, 
estão nos seus pontos centrais.   
Os resultados obtidos nos presentes experimentos são semelhantes aos 
relatados por Yu et al. (2009), que otimizaram as concentrações de nutrientes 
em meio sintético e notaram um efeito significativo do extrato de levedura sobre 
a biomassa, quando o mesmo está  associado à fonte de carbono. Os autores 
observaram  que  o  aumento  da  concentração  de  sulfato de amônio  resulta  em 
um  aumento  na  produção  de  etanol;  entretanto,  em  níveis  elevados  podem 
causar  inibição.  Assim  como  tais  pesquisadores,  nenhuma  variação 
significativa  foi  observada  com  a  adição  de  fontes  de  fosfato  e  nitrogênio, 
tornando o fosfato de potássio, bem como o sulfato de amônio estatisticamente 
insignificantes.  Provavelmente,  o  excesso  de  nitrogênio  pode  promover  maior 
produção de biomassa em relação à produção de etanol. 
A reprodução das melhores condições estabelecidas pelo  planejamento 
experimental, relação de sólido:líquido de 3:10 (g:mL), carga enzimática de 25 
FPU/g  e  concentração  celular  de  4  g/L,  foi  realizada  em  biorreator 
instrumentado,  atingindo  65  g/L  de  concentração  de  etanol,  e  produtividade 
final  de  2,70  g/L.h,  a  partir  de  85  g/L  de  glicose  inicial  do  processo,  na 
temperatura de 30ºC, agitação orbital de 150 rpm e pH 5 (Figura 5.15).  
Os resultados obtidos mostraram que foi possível otimizar a produção de 
etanol  através  da  análise  da  adição  de  nutrientes  no  meio  de  fermentação, 
após a execução de planejamentos experimentais sequenciais. Foi constatado 
que  o  aumento  da  concentração  de  KH
2
PO
4
,  o  qual  possui  fósforo,  utilizado 
nas  vias  metabólicas  do  mecanismo  energético  das  células,  foi  o  principal 
responsável  pelo  aumento  da  concentração  de  etanol,  seguido  do  extrato  de 
levedura, MgSO
4
.7H
2
O e (NH
4
)
2
SO
4
. Dessa forma, as condições ótimas obtidas 

CAPÍTULO 5: Resultados e Discussões 
 
Danielle da Silveira dos Santos 
139     
para o processo SSF a partir do bagaço de cana foram as seguintes: extrato de 
levedura (12,5 g/L), KH
2
PO
4
 (2,5 g/L), (NH
4
)
2
SO
4
 (1,5 g/L) e MgSO
4
 (1,5 g/L), 
resultando  na  concentração  máxima  de  etanol  em  65  g/L,  com  85  g/L  de 
concentração inicial de glicose, atingindo a maior produtividade volumétrica de 
2,63  g/L.h,  na  temperatura  de  30ºC,  agitação  orbital  de  150rpm  e  pH  5  em 
biorreator instrumentado. 
 
Figura  5.15.  Perfil  cinético  da  produção  de etanol  a  partir  de  bagaço  de  cana 
pré-tratado,  na  relação  sólido:líquido  3:10  (g:mL)  e  carga  enzimática  de  25 
FPU/  g,  através  do  processo  SSF  por  Z.  mobilis  CP4,  utilizando  12,5  g/L  de 
extrato  de  levedura,  2,5  g/L  de  KH
2
PO
4
,  1,5  g/L  de  (NH
4
)
2
SO
4
  e  1,5  g/L 
MgSO
4
.7H
2
O  no  meio  fermentativo.  P.H.=  pré-hidrólise  enzimática,  SSF: 
fermentação e sacarificação simultâneas. 
II. 
Resíduo da indústria de celulose  
O  mesmo  planejamento  experimental  utilizado  anteriormente,  para  a 
avaliação  da  adição  de  nutrientes  adicionados  na  fermentação  a  partir  do 
bagaço  de  cana  pré-tratado,  foi  empregado  no  processo  SSF  a  partir  de 
resíduo  da  indústria  de  celulose,  avaliando  diferentes  concentrações  de 
nutrientes adicionais,  extrato  de levedura,  KH
2
PO
4
,  (NH
4
)
2
SO
4
  e  MgSO
4
.7H
2
O 
(Tabela 5.12).  
P.H. 
SSF 

CAPÍTULO 5: Resultados e Discussões 
 
Danielle da Silveira dos Santos 
140     
Tabela  5.12.  Planejamento  Superfície  de  Resposta  2
4
  investigando  efeitos  da 
adição  de  extrato  de  levedura,  KH
2
PO
4
,  (NH4)
2
SO
4
  e  MgSO
4
.7H
2
O  na 
produção  de  etanol  a  partir  de  resíduos  da  indústria  de  celulose,  na  relação 
sólido:líquido  2:10  (g:mL)  e  carga  enzimática  de  17,5  FPU/  g,  por  Z.  mobilis 
CP4. 
  
 
Ex. 
Variáveis 
Resposta 
E. L.  
(g/L) 
KH
2
PO
4
 
(g/L) 
(NH
4
)
2
 SO